鮑曼不動桿菌生物膜形成與耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:鮑曼不動桿菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一，其生物膜(Biofilm)作為主要的毒力因子，參與了鮑曼不動桿菌的粘附、耐藥、應對環(huán)境變化、免疫逃逸等多個方面。本研究旨在探索鮑曼不動桿菌生物膜形成在臨床分離株耐藥中的作用，從而為制定預防和治療鮑曼不動桿菌引起的醫(yī)院感染的措施提供理論依據(jù)。
　　方法:美國MicroScanWalkAway全自動細菌鑒定及藥敏分析儀進行臨床分離鮑曼不動桿菌的鑒定與耐藥譜檢測；LB培養(yǎng)液培養(yǎng)鮑曼

2、不動桿菌，測定生長曲線以確定其對數(shù)期，后續(xù)工作均采用對數(shù)期生長的細菌進行實驗；采用96孔板培養(yǎng)法模擬細菌生物膜在體內(nèi)的生長，結(jié)晶紫染色法測定各菌株生物膜形成能力；通過鮑曼不動桿菌在黑色聚碳酸酯膜上形成生物膜，生物膜上覆蓋硝酸纖維素膜與氯霉素和氧氟沙星的藥敏紙片，組成“三明治”結(jié)構(gòu)(即黑色聚碳酸酯膜-生物膜-藥敏紙片)，將此結(jié)構(gòu)置于涂有大腸埃希菌ATCC25922菌株的M-H平板上，以檢測生物膜對氯霉素和氧氟沙星的滲透限制作用；針對耐藥譜

3、中不同種類抗生素選取相應的四種耐藥基因，即β-內(nèi)酰胺酶基因TEM、碳青霉烯酶基因OXA-23、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat和外排泵編碼基因adeB。應用PCR與熒光定量PCR技術(shù)檢測以上四種耐藥基因在各菌株中的存在情況及其在細菌游離態(tài)和生物膜狀態(tài)的表達差異。
　　結(jié)果:臨床分離的7株鮑曼不動桿菌(編號為1、2、10、65、67、78、85)經(jīng)檢測均為多重耐藥菌株(multi-drugresistance，MDR)；結(jié)晶紫染色檢測各菌

4、株均能于體外形成生物膜，其中2號菌株的生物膜形成能力較弱，而10、65、67、78號菌株較強，1號與85號菌株生物膜形成能力居中。建立的黑色聚碳酸酯膜模型檢測各菌株生物膜對氯霉素和氧氟沙星的滲透限制作用，結(jié)果顯示，除85號菌株外，其余各菌株與對照組相比，對氯霉素均有明顯的滲透限制作用，而對氧氟沙星則無明顯作用。應用PCR技術(shù)檢測了cat、OXA-23、TEM、adeB四種耐藥基因在各菌株中的存在情況，結(jié)果顯示TEM基因和cat基因普遍存

5、在于耐藥菌株中；外排泵基因adeB在67、78號菌株中均呈陽性；針對亞胺培南的耐藥基因OXA-23僅存在于對亞胺培南耐藥的67、78號菌株中。應用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了65號、10號菌株TEM基因、cat基因在游離態(tài)細菌和生物膜狀態(tài)細菌中的表達差異，結(jié)果顯示，該基因在生物膜狀態(tài)的表達明顯低于游離態(tài)細菌；檢測了67號、78號菌株TEM基因、adeB基因、OXA-23基因、cat基因在游離態(tài)細菌和生物膜狀態(tài)細菌的表達差異，四種耐藥基因

6、在生物膜狀態(tài)的表達均低于游離態(tài)。
　　結(jié)論:本研究中臨床分離所得鮑曼不動桿菌均為多重耐藥菌株，所選抗生素中敏感率以舒普深(頭孢哌酮/舒巴坦鈉)與亞胺培南最高。96孔板培養(yǎng)法可以很好的模擬細菌生物膜的生長，臨床分離菌株均能于體外形成生物膜，但生物膜形成能力有差異。結(jié)晶紫染色可以有效的檢測鮑曼不動桿菌生物膜形成能力。建立的“三明治”模型，即黑色聚碳酸酯膜-生物膜-藥敏紙片方法，可用于檢測生物膜形成對藥物的滲透限制作用。本實驗檢測了氯霉

7、素和氧氟沙星兩種抗生素，結(jié)果顯示，生物膜形成對氯霉素的滲透有限制作用，而對氧氟沙星則無此作用，表明滲透限制是生物膜對某些抗生素耐藥的機制之一，但不能完全解釋所有生物膜耐藥現(xiàn)象。TEM基因、cat基因在臨床分離鮑曼不動桿菌菌株中普遍存在，介導對β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類抗生素的耐藥；OXA-23基因存在于對亞胺培南耐藥的菌株中；adeB外排泵基因的存在也是導致鮑曼不動桿菌耐藥的重要原因之一。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，TEM、adeB、OXA