鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成與耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一，其生物膜(Biofilm)作為主要的毒力因子，參與了鮑曼不動(dòng)桿菌的粘附、耐藥、應(yīng)對(duì)環(huán)境變化、免疫逃逸等多個(gè)方面。本研究旨在探索鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成在臨床分離株耐藥中的作用，從而為制定預(yù)防和治療鮑曼不動(dòng)桿菌引起的醫(yī)院感染的措施提供理論依據(jù)。
　　方法:美國(guó)MicroScanWalkAway全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀進(jìn)行臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌的鑒定與耐藥譜檢測(cè)；LB培養(yǎng)液培養(yǎng)鮑曼

2、不動(dòng)桿菌，測(cè)定生長(zhǎng)曲線以確定其對(duì)數(shù)期，后續(xù)工作均采用對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；采用96孔板培養(yǎng)法模擬細(xì)菌生物膜在體內(nèi)的生長(zhǎng)，結(jié)晶紫染色法測(cè)定各菌株生物膜形成能力；通過(guò)鮑曼不動(dòng)桿菌在黑色聚碳酸酯膜上形成生物膜，生物膜上覆蓋硝酸纖維素膜與氯霉素和氧氟沙星的藥敏紙片，組成“三明治”結(jié)構(gòu)(即黑色聚碳酸酯膜-生物膜-藥敏紙片)，將此結(jié)構(gòu)置于涂有大腸埃希菌ATCC25922菌株的M-H平板上，以檢測(cè)生物膜對(duì)氯霉素和氧氟沙星的滲透限制作用；針對(duì)耐藥譜

3、中不同種類(lèi)抗生素選取相應(yīng)的四種耐藥基因，即β-內(nèi)酰胺酶基因TEM、碳青霉烯酶基因OXA-23、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat和外排泵編碼基因adeB。應(yīng)用PCR與熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)以上四種耐藥基因在各菌株中的存在情況及其在細(xì)菌游離態(tài)和生物膜狀態(tài)的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:臨床分離的7株鮑曼不動(dòng)桿菌(編號(hào)為1、2、10、65、67、78、85)經(jīng)檢測(cè)均為多重耐藥菌株(multi-drugresistance，MDR)；結(jié)晶紫染色檢測(cè)各菌

4、株均能于體外形成生物膜，其中2號(hào)菌株的生物膜形成能力較弱，而10、65、67、78號(hào)菌株較強(qiáng)，1號(hào)與85號(hào)菌株生物膜形成能力居中。建立的黑色聚碳酸酯膜模型檢測(cè)各菌株生物膜對(duì)氯霉素和氧氟沙星的滲透限制作用，結(jié)果顯示，除85號(hào)菌株外，其余各菌株與對(duì)照組相比，對(duì)氯霉素均有明顯的滲透限制作用，而對(duì)氧氟沙星則無(wú)明顯作用。應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)了cat、OXA-23、TEM、adeB四種耐藥基因在各菌株中的存在情況，結(jié)果顯示TEM基因和cat基因普遍存

5、在于耐藥菌株中；外排泵基因adeB在67、78號(hào)菌株中均呈陽(yáng)性；針對(duì)亞胺培南的耐藥基因OXA-23僅存在于對(duì)亞胺培南耐藥的67、78號(hào)菌株中。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了65號(hào)、10號(hào)菌株TEM基因、cat基因在游離態(tài)細(xì)菌和生物膜狀態(tài)細(xì)菌中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，該基因在生物膜狀態(tài)的表達(dá)明顯低于游離態(tài)細(xì)菌；檢測(cè)了67號(hào)、78號(hào)菌株TEM基因、adeB基因、OXA-23基因、cat基因在游離態(tài)細(xì)菌和生物膜狀態(tài)細(xì)菌的表達(dá)差異，四種耐藥基因

6、在生物膜狀態(tài)的表達(dá)均低于游離態(tài)。
　　結(jié)論:本研究中臨床分離所得鮑曼不動(dòng)桿菌均為多重耐藥菌株，所選抗生素中敏感率以舒普深(頭孢哌酮/舒巴坦鈉)與亞胺培南最高。96孔板培養(yǎng)法可以很好的模擬細(xì)菌生物膜的生長(zhǎng)，臨床分離菌株均能于體外形成生物膜，但生物膜形成能力有差異。結(jié)晶紫染色可以有效的檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成能力。建立的“三明治”模型，即黑色聚碳酸酯膜-生物膜-藥敏紙片方法，可用于檢測(cè)生物膜形成對(duì)藥物的滲透限制作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了氯霉

7、素和氧氟沙星兩種抗生素，結(jié)果顯示，生物膜形成對(duì)氯霉素的滲透有限制作用，而對(duì)氧氟沙星則無(wú)此作用，表明滲透限制是生物膜對(duì)某些抗生素耐藥的機(jī)制之一，但不能完全解釋所有生物膜耐藥現(xiàn)象。TEM基因、cat基因在臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌菌株中普遍存在，介導(dǎo)對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氯霉素類(lèi)抗生素的耐藥；OXA-23基因存在于對(duì)亞胺培南耐藥的菌株中；adeB外排泵基因的存在也是導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的重要原因之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，TEM、adeB、OXA