紅霉素破壞鮑曼不動桿菌生物膜與I類整合子的關系的實驗研究.pdf

1、目的：(1)統(tǒng)計分析我院2015年4月-10月臨床送檢微生物標本中鮑曼不動桿菌（Ab）的Ⅰ類整合子(intI)檢出率、耐藥性及生物膜形成率；建立Ab體外生物膜(BF)模型，采用掃描電鏡觀察生物膜形成過程；(2)檢測紅霉素破壞鮑曼不動桿菌生物膜后Ⅰ類整合酶基因(intI1)mRNA的表達情況，初步探討紅霉素破壞Ab生物膜與Ⅰ類整合子的關系，進一步探明紅霉素破壞Ab生物膜機制，從而為臨床用藥提供實驗依據，更好的指導臨床抗生素的合理使用，同時

2、也有益于研發(fā)新的臨床藥物。
　　方法：(1)收集我院2015年4月-10月臨床送檢的微生物標本，全自動細菌分析儀鑒定為Ab，普通PCR鑒定Ⅰ類整合子陽性菌，K-B紙片擴散法檢測Ab藥物敏感情況，阿利新藍-剛果紅染色鑒定Ab生物膜，選取能形成BF的Ab菌株建立生物膜體外模型，分別在24h、48h、72h、5d掃描電鏡觀察Ab生物膜形態(tài)。(2)選取AbⅠ類整合子陽性菌中生物膜陽性菌株和陰性菌株，實驗分為A、B、C3大組：組A為生物膜培

3、養(yǎng)狀態(tài)下的Ab生物膜菌，組B為Ab不成膜菌，組C為液相培養(yǎng)狀態(tài)下的A組菌。每組內設實驗組1（加紅霉素）和對照組2（不加紅霉素）。分別于24h、48h、72h、5d熒光定量PCR檢測I類整合酶基因mRNA的表達情況。mRNA相對表達數(shù)據采用2–△△CT法進行分析，用SPSS22進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：(1)本課題共收集臨床送檢Ab64例，檢出I類整合子陽性菌54例；藥敏結果顯示Ⅰ類整合子基因盒陽性菌株對哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢他

4、啶、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氯霉素等抗生素的耐藥率明顯高于未攜帶整合子相關基因盒的菌株，提示I類整合子在Ab臨床分離株中發(fā)揮耐藥作用；阿利新藍-剛果紅染色，其中Ⅰ類整合子陽性菌成膜率高約為81.5％；掃描電鏡觀察：Ab在培養(yǎng)72h時形成成熟生物膜，且Ⅰ類整合子陽性株較陰性株細菌密集且成膜明顯。(2)本研究對紅霉素在破壞Ab生物膜中的作用機制進行了研究，采用普通PCR檢測到Ab在液相浮游菌、生物膜菌兩種不同生長狀態(tài)下，都有Ⅰ類整合子

5、整合酶基因mRNA的表達；采用熒光定量PCR技術對該菌在以上實驗分組條件下Ⅰ類整合酶基因mRNA轉錄水平進行定量分析，發(fā)現(xiàn)A2組I類整合酶基因的mRNA表達水平在多個時間點極顯著（p≤0.01）高于B2組，顯著性（p<0.05）高于C2組，且隨著時間的推移差異越大，1d和5d后分別是B2組的2.39、15.67倍，C2組的2、4.06倍，說明生物膜有利于intI1的表達；實驗組和對照組，在紅霉素作用后1d，Ⅰ類整合酶基因的mRNA表達出

6、現(xiàn)下降，作用后3d mRNA表達出現(xiàn)明顯下降，其中在紅霉素作用后5d差異性表達最為極顯著（P≤0.01），A2、B2、C2分別為A1、B1、C1的40.78、35.26、29.45倍。A1較A2組在各個時間點表現(xiàn)為顯著性（p<0.05）下調，說明紅霉素對intI1的mRNA的表達有影響；B1較B2組在各個時間點表現(xiàn)為顯著性（p<0.05）下調，說明紅霉素可以破壞Ⅰ類整合子；C1較C2組在各個時間點表現(xiàn)為顯著性（p<0.05）下調，進一步

7、說明紅霉素可以破壞Ⅰ類整合子。本研究結果提示Ab生物膜的形成有利于整合子及相關耐藥基因的傳播，紅霉素可能在破壞AbⅠ類整合子上起到一定的作用。對研究整合子在生物膜中的作用機制及細菌耐藥性形成傳播提供實驗依據，并為進一步開發(fā)新的藥物以及控制細菌耐藥性的形成及播散提供新的思路。
　　結論：(1)我院AbⅠ類整合子陽性檢出率高，且較陰性菌易形成生物膜，耐藥率高；(2)Ab在生物膜狀態(tài)下Ⅰ類整合酶基因mRNA的表達較液相狀態(tài)表達高；紅霉素