紅霉素破壞鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜與I類整合子的關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1)統(tǒng)計(jì)分析我院2015年4月-10月臨床送檢微生物標(biāo)本中鮑曼不動(dòng)桿菌（Ab）的Ⅰ類整合子(intI)檢出率、耐藥性及生物膜形成率；建立Ab體外生物膜(BF)模型，采用掃描電鏡觀察生物膜形成過(guò)程；(2)檢測(cè)紅霉素破壞鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜后Ⅰ類整合酶基因(intI1)mRNA的表達(dá)情況，初步探討紅霉素破壞Ab生物膜與Ⅰ類整合子的關(guān)系，進(jìn)一步探明紅霉素破壞Ab生物膜機(jī)制，從而為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，更好的指導(dǎo)臨床抗生素的合理使用，同時(shí)

2、也有益于研發(fā)新的臨床藥物。
　　方法：(1)收集我院2015年4月-10月臨床送檢的微生物標(biāo)本，全自動(dòng)細(xì)菌分析儀鑒定為Ab，普通PCR鑒定Ⅰ類整合子陽(yáng)性菌，K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)Ab藥物敏感情況，阿利新藍(lán)-剛果紅染色鑒定Ab生物膜，選取能形成BF的Ab菌株建立生物膜體外模型，分別在24h、48h、72h、5d掃描電鏡觀察Ab生物膜形態(tài)。(2)選取AbⅠ類整合子陽(yáng)性菌中生物膜陽(yáng)性菌株和陰性菌株，實(shí)驗(yàn)分為A、B、C3大組：組A為生物膜培

3、養(yǎng)狀態(tài)下的Ab生物膜菌，組B為Ab不成膜菌，組C為液相培養(yǎng)狀態(tài)下的A組菌。每組內(nèi)設(shè)實(shí)驗(yàn)組1（加紅霉素）和對(duì)照組2（不加紅霉素）。分別于24h、48h、72h、5d熒光定量PCR檢測(cè)I類整合酶基因mRNA的表達(dá)情況。mRNA相對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)采用2–△△CT法進(jìn)行分析，用SPSS22進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：(1)本課題共收集臨床送檢Ab64例，檢出I類整合子陽(yáng)性菌54例；藥敏結(jié)果顯示Ⅰ類整合子基因盒陽(yáng)性菌株對(duì)哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢他

4、啶、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氯霉素等抗生素的耐藥率明顯高于未攜帶整合子相關(guān)基因盒的菌株，提示I類整合子在Ab臨床分離株中發(fā)揮耐藥作用；阿利新藍(lán)-剛果紅染色，其中Ⅰ類整合子陽(yáng)性菌成膜率高約為81.5％；掃描電鏡觀察：Ab在培養(yǎng)72h時(shí)形成成熟生物膜，且Ⅰ類整合子陽(yáng)性株較陰性株細(xì)菌密集且成膜明顯。(2)本研究對(duì)紅霉素在破壞Ab生物膜中的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，采用普通PCR檢測(cè)到Ab在液相浮游菌、生物膜菌兩種不同生長(zhǎng)狀態(tài)下，都有Ⅰ類整合子

5、整合酶基因mRNA的表達(dá)；采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)該菌在以上實(shí)驗(yàn)分組條件下Ⅰ類整合酶基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)A2組I類整合酶基因的mRNA表達(dá)水平在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)極顯著（p≤0.01）高于B2組，顯著性（p<0.05）高于C2組，且隨著時(shí)間的推移差異越大，1d和5d后分別是B2組的2.39、15.67倍，C2組的2、4.06倍，說(shuō)明生物膜有利于intI1的表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，在紅霉素作用后1d，Ⅰ類整合酶基因的mRNA表達(dá)出

6、現(xiàn)下降，作用后3d mRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，其中在紅霉素作用后5d差異性表達(dá)最為極顯著（P≤0.01），A2、B2、C2分別為A1、B1、C1的40.78、35.26、29.45倍。A1較A2組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)為顯著性（p<0.05）下調(diào)，說(shuō)明紅霉素對(duì)intI1的mRNA的表達(dá)有影響；B1較B2組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)為顯著性（p<0.05）下調(diào)，說(shuō)明紅霉素可以破壞Ⅰ類整合子；C1較C2組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)為顯著性（p<0.05）下調(diào)，進(jìn)一步

7、說(shuō)明紅霉素可以破壞Ⅰ類整合子。本研究結(jié)果提示Ab生物膜的形成有利于整合子及相關(guān)耐藥基因的傳播，紅霉素可能在破壞AbⅠ類整合子上起到一定的作用。對(duì)研究整合子在生物膜中的作用機(jī)制及細(xì)菌耐藥性形成傳播提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的藥物以及控制細(xì)菌耐藥性的形成及播散提供新的思路。
　　結(jié)論：(1)我院AbⅠ類整合子陽(yáng)性檢出率高，且較陰性菌易形成生物膜，耐藥率高；(2)Ab在生物膜狀態(tài)下Ⅰ類整合酶基因mRNA的表達(dá)較液相狀態(tài)表達(dá)高；紅霉素