鮑曼不動桿菌耐藥持留菌的形成機制研究.pdf

1、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanmii)是一種重要的院內感染致病菌，能夠引發(fā)呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等。鮑曼不動桿菌耐藥問題一直是臨床感染治療的最大障礙。持留菌的存在可能是其臨床治療失敗和感染復發(fā)的真正原因，同時也是導致耐藥率不斷上升的原因之一。近些年持留菌引起的耐藥問題受到廣泛重視，鮑曼不動桿菌持留菌的基本特征及形成機制的研究對于更好的控制持留菌引起的耐藥及感染問題具有重要的指導意義，也為其他物種中持留菌的研究提

2、供理論依據(jù)。
　　本研究以鮑曼不動桿菌標準株ATCC19606為研究對象，開展鮑曼不動桿菌耐藥持留菌的基本特征及其形成機制的研究。首先檢測了鮑曼不動桿菌的生長曲線和抗生素抗性譜。生長曲線測定結果幫助確定鮑曼不動桿菌的對數(shù)期與平臺期的培養(yǎng)時間?？剐宰V的測定結果與美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)制定的標準比較發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌標準株ATCC19606抗生素的抗性水平較低:對多數(shù)(9/13)抗生素敏感，僅對氨芐西林(AMP)和頭孢吡肟

3、(CPM)耐藥。這些結果為后續(xù)實驗時間點的選取和抗生素的選擇提供了實驗依據(jù)。
　　本研究首先優(yōu)化了分離及定量鮑曼不動桿菌的持留菌細胞的方法，比較了不同的生理狀態(tài)下以及不同的抗生素壓力條件下鮑曼不動桿菌持留菌水平的差異情況。實驗結果表明鮑曼不動桿菌在持留菌的形成過程中具有與其他細菌類似的二相型死亡曲線，即大量敏感細菌快速裂解死亡，而持留菌的量維持相對穩(wěn)定。平臺期的細菌菌群中含有的持留菌比例要顯著高于對數(shù)生長期，說明鮑曼不動桿菌的持留

4、菌水平與菌株的生理狀態(tài)密切相關。此外，持留菌的形成呈現(xiàn)出十分明顯的抗生素種類和濃度依賴性，不同的抗生素的死亡曲線的情況大不相同，其中多粘菌素B(PB)與高濃度的妥布霉素(TOB)具有消除持留菌細胞的能力。以上這些結果讓我們對鮑曼不動桿菌持留菌的基本特征有了進一步的認識。借助生物信息學工具對721株已測序的鮑曼不動桿菌基因組中可能的Ⅱ型毒素-抗毒素系統(tǒng)（TA系統(tǒng)）進行了徹底的搜索，結果表明鮑曼不動桿菌持留菌的中Ⅱ型TA系統(tǒng)十分多樣，包含至

5、少15對的TA系統(tǒng)。我們挑選其中報道有功能的5對TA系統(tǒng)，分別為RelB/RelE、HicA/HicB、GP49/Cro(HigB/HigA)、HTH/GNAT及DUF497/COG3514系統(tǒng)，在44株臨床多耐藥鮑曼不動桿菌菌株中的分布情況做了進一步分析。結果表明，HTH/GNAT、GP49/Cro(HigB/HigA)與DUF497/COG3514的分布十分廣泛廣泛，分別占總菌株的61％、56％和40％。另一方面，real-time

6、 PCR的方法對持留菌與非持留菌中Ⅱ型TA系統(tǒng)的表達量進行了確認，結果表明持留菌中3類Ⅱ型TA系統(tǒng)(GP49/Cro(HigB/HigA)、HTH/GNAT及DUF497/COG3514）的表達量要顯著高于非持留菌。以上結果表明3類Ⅱ型TA系統(tǒng)在持留菌形成過程中扮演重要角色。
　　本文借助Miseq高通量測序平臺在轉錄組水平上對持留菌形成及恢復生長的整個過程中差異表達的基因和基因所富集到的通路進行了分析。結果表明在加入抗生素的第一

7、個小時和重新培養(yǎng)的第5小時差異表達的基因數(shù)目最多，上調和下調2倍的基因數(shù)目分別是898個、566個和704個、964個。差異表達的基因所富集的通路分析結果表明碳水化合物代謝途徑和能量代謝途徑在持留菌形成和恢復生長過程中均有表達，而異源物質的生物降解途徑在持留菌形成階段特異存在，推測異源物質降解相關基因在持留菌形成過程中扮演了重要角色。聚類分析找到了一些在持留菌時期表達量升高而在持留菌恢復生長時下降的基因，另外對4類TA系統(tǒng)的表達情況的結