鎘暴露致小鼠卵巢顆粒細胞激素合成障礙中Sf-1基因的表達及其DNA的甲基化.pdf

1、目的：
　　通過體外培養(yǎng)26日齡小鼠卵巢顆粒細胞，觀察不同濃度、不同時間鎘暴露后顆粒細胞形態(tài)及激素分泌功能的改變，探討鎘暴露致未成年小鼠卵巢顆粒細胞激素合成障礙中Sf-1基因的表達及其DNA的甲基化情況，為進一步研究鎘暴露對卵巢細胞功能的影響及其機制提供新思路。
　　方法：
　　提取26日齡雌性ICR小鼠卵巢顆粒細胞進行體外培養(yǎng)，待細胞貼壁，形態(tài)穩(wěn)定后，將細胞隨機分為四組，分別加入含終濃度為0、10、20、40μM的氯

2、化鎘的細胞培養(yǎng)液，待染毒結(jié)束后處理。分別于染毒2h、4h、6h、8h后進行：1、倒置顯微鏡下觀察顆粒細胞形態(tài)學的變化；2、ELISA法檢測顆粒細胞培養(yǎng)液中E2及P4濃度；3、實時熒光定量PCR法檢測Sf-1基因mRNA表達變化情況；4、Western blotting法檢測SF-1蛋白表達變化情況；5、于染毒6 h后，提取顆粒細胞DNA，結(jié)合堿基特異性酶切反應(yīng)與MALDI-TOF-MS檢測原理，運用Sequenom公司的MassARRA

3、Y檢測系統(tǒng)，檢測Sf-1基因啟動子區(qū)DNA甲基化情況。
　　結(jié)果：
　　1.鎘對卵巢顆粒細胞形態(tài)學的影響：隨著鎘染毒劑量的增加和時間的延長，卵巢顆粒細胞發(fā)生形態(tài)學改變，染毒組與對照組比較，細胞數(shù)量減少，細胞突觸收起，細胞變圓，折光性變強，高劑量組可見部分漂浮的死細胞，且隨著染毒時間的延長，死細胞增多。
　　2.（1）鎘對卵巢顆粒細胞E2分泌水平的影響：①同一染毒時間下，隨著染毒劑量的增加，顆粒細胞培養(yǎng)液中雌激素水平存在

4、下降趨勢（趨勢性檢驗P<0.01）。其中分別染毒2 h和4 h后，20μM、40μM組細胞培養(yǎng)液中的E2水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；染毒6 h和8 h后，10μM、20μM、40μM組細胞培養(yǎng)液中的E2水平明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。②同一染毒劑量下，隨著染毒時間的增加，顆粒細胞培養(yǎng)液中雌激素水平存在升高的趨勢（趨勢性檢驗P<0.05）.其中，在10μM劑量下，染毒4 h后培養(yǎng)液中 E2水

5、平與染毒2 h后的水平相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Control組、20μM、40μM染毒劑量下，培養(yǎng)4 h、8 h后，培養(yǎng)液中E2水平與培養(yǎng)2 h后的水平相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　（2）鎘對卵巢顆粒細胞P4分泌水平的影響：①同一染毒時間不同染毒劑量的變化：染毒2 h后，10μM、20μM組培養(yǎng)液中的P4水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；染毒4 h后，隨著染毒劑

6、量的增加，顆粒細胞培養(yǎng)液中P4水平存在下降趨勢（趨勢性檢驗P<0.05），其中20μM、40μM組培養(yǎng)液中的P4水平明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；分別染毒6 h和8 h后各劑量組培養(yǎng)液中的P4水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。②同一染毒劑量不同染毒時間的變化：Control組、10μM、40μM染毒劑量下，隨著培養(yǎng)時間的增加，培養(yǎng)液中P4水平存在升高趨勢（趨勢性檢驗P<0.05）。其中，0μM組經(jīng)

7、8h培養(yǎng)后，培養(yǎng)液中P4水平與染毒2 h后的比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在10μM劑量下，染毒4 h、6 h、8 h后培養(yǎng)液中 P4水平與染毒2 h后的比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在20μM劑量下，染毒4 h后培養(yǎng)液中 P4水平與染毒2 h后的比較明顯降低（P<0.05）。
　　3．鎘對卵巢顆粒細胞Sf-1基因的mRNA表達的影響：（1）同一染毒時間不同染毒劑量變化：分別染毒2 h后，各

8、染毒組顆粒細胞Sf-1基因mRNA表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；分別染毒4 h、6 h、8 h后，各染毒組 Sf-1基因 mRNA表達水平均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且4 h、6 h、8 h實驗組Sf-1基因的mRNA表達水平隨著染毒劑量的增加存在著下降的趨勢（趨勢性檢驗P<0.01）。（2）同一染毒劑量不同染毒時間變化：在10μM、20μM、40μM染毒劑量下，Sf-1基因mRNA表達水

9、平隨著染毒時間的延長而下降（趨勢性檢驗P<0.05）。其中，10μM劑量下染毒8 h后，Sf-1基因mRNA表達水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；20μM劑量下染毒6 h后，Sf-1基因mRNA表達水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；40μM劑量下分別染毒6 h、8 h后，Sf-1基因mRNA表達水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0

10、.05）。
　　4.鎘對卵巢顆粒細胞SF-1蛋白表達的影響：（1）同一染毒時間不同染毒劑量變化：分別染毒2 h后，各染毒組顆粒細胞SF-1蛋白的表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；分別染毒4 h后，20μM、40μM組SF-1蛋白表達水平均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；分別染毒6 h、8 h后，各染毒組SF-1蛋白表達水平均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且4h、6h、8h實驗

11、組SF-1蛋白表達水平隨著染毒劑量的增加存在著下降的趨勢（趨勢性檢驗P<0.01）。（2）同一染毒劑量不同染毒時間變化：在10μM、20μM、40μM染毒劑量下，SF-1蛋白表達水平隨著染毒時間的延長而下降（趨勢性檢驗P<0.01）。其中，10μM劑量下染毒6 h、8 h后，SF-1蛋白表達水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在20μM、40μM劑量下，染毒4 h、6 h、8 h后，SF-1蛋白表達

12、水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　5、鎘對卵巢顆粒細胞Sf-1基因DNA甲基化的影響：用Sequenom DNA甲基化檢測平臺實際檢測到的CG位點為9個，但是由于第7、8、9位點有些劑量組CG位點的甲基化率為0，所以最終納入分析的為1-6位點，數(shù)據(jù)經(jīng)整理分析結(jié)果顯示Sf-1基因各組總體甲基化率均呈現(xiàn)較低甲基化，且與溶劑對照組比較，DAC處理組及各CdCl2染毒組Sf-1基因DNA啟動子

13、區(qū)CG位點甲基化率無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、在本次實驗條件下，鎘對小鼠卵巢顆粒細胞存在一定的毒性作用，表現(xiàn)在細胞形態(tài)學上的改變，及一定劑量范圍內(nèi)抑制卵巢顆粒細胞分泌雌二醇和孕酮。
　　2、體外鎘（10-40μM）暴露后，Sf-1基因 mRNA和蛋白表達下調(diào)，可能是鎘致激素分泌及合成障礙的重要機制之一。
　　3、鎘暴露卵巢顆粒細胞后Sf-1基因啟動子區(qū)DNA呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)