針刺和熱脅迫下家蠅幼蟲的血淋巴蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、目的：分析家蠅幼蟲免疫誘導前后血淋巴中的免疫防御相關活性蛋白分子，以期獲得家蠅幼蟲的功能蛋白表達譜，為探索家蠅免疫機制、昆蟲抗菌肽等活性蛋白的鑒定和開發(fā)等研究提供研究線索和理論依據(jù)。
　　方法：采用針刺和熱誘導方法刺激家蠅幼蟲，以破壁法制備家蠅幼蟲血淋巴；采用2-D電泳技術對家蠅幼蟲血淋巴標本差異蛋白進行初步篩選；采用同位素標記及相對定量技術(isobaric tags for relative and absolute quan

2、tification，iTRAQ)結(jié)合2D LC-MS/MS對家蠅幼蟲誘導前后的血淋巴蛋白質(zhì)組進行研究，使用uniprot.insecta.fasta數(shù)據(jù)庫對在家蠅幼蟲血淋巴差異蛋白質(zhì)進行細胞定位、生物過程和分子功能分析；采用熒光定量技術PCR驗證差異蛋白質(zhì)的表達情況，使用2-△△Ct分析法對目的基因進行相對定量檢測；采用熒光定量PCR技術研究家蠅幼蟲不同發(fā)育階段差異蛋白基因的表達情況。
　　結(jié)果：1、正常血淋巴雙向電泳：共檢測到

3、601個蛋白點，蛋白點分子量主要分布在10kD-66kD之間，等電點主要分布在pH4-7之間。2、iTRAQ結(jié)合2D LC-MS/MS分析誘導前后差異蛋白：與對照組比較研究后，鑒定到539個差異蛋白質(zhì)，其中100個蛋白質(zhì)具有定量信息。針刺誘導后顯著上調(diào)的蛋白有10個，下調(diào)蛋白3個(P<0.05)；熱誘導后顯著上調(diào)的蛋白有4個，下調(diào)蛋白8個(P<0.05)。對鑒定到的差異蛋白進行理化性質(zhì)分析和GO(gene ontology)注釋分析發(fā)現(xiàn)

4、這些蛋白分別具有抗菌、抗氧化、催化結(jié)合等功能，并參與了免疫、代謝、應激、轉(zhuǎn)運等生物學過程，表明對家蠅幼蟲經(jīng)誘導后其血淋巴中多種功能蛋白的表達發(fā)生了變化。兩種方法誘導后雙翅肽的表達均有顯著性上調(diào)，3-磷酸甘油醛脫氫酶和殼聚糖結(jié)合蛋白的表達均有顯著性下調(diào)。3、熒光定量pcr表達差異蛋白基因：共表達了11個差異蛋白基因，針刺誘導組差異蛋白基因的表達水平均為上調(diào)；而熱誘導組差異蛋白基因中有1個基因表達上調(diào)，2個基因的表達水平下調(diào)，其它差異蛋白基

5、因的表達水平無明顯變化。針刺誘導和熱誘導均有顯著性上調(diào)的差異蛋白基因為雙翅肽，而均呈顯著性下調(diào)的基因為氧化還原酶。4、雙翅肽、熱休克蛋白、微管蛋白、磷酸果糖醛縮酶4個差異蛋白基因在家蠅三齡幼蟲不同發(fā)育階段的熒光定量 PCR研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導后雙翅肽的表達量3小時開始上升，24小時達高峰之后開始下降，48小時后仍有表達；熱休克蛋白的表達量在誘導后也有明顯上升，12小時后達到最高峰，之后開始下降，48小時后表達水平與誘導后3小時相當;微管蛋白

6、和磷酸果糖醛縮酶在家蠅三齡幼蟲的各發(fā)育階段的表達量無明顯變化。
　　結(jié)論：1、本研究首次將 iTRAQ標記結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術用于昆蟲血淋巴蛋白組的研究。建立針刺和熱誘導后的差異蛋白質(zhì)表達譜，數(shù)據(jù)顯示鑒定到539個蛋白質(zhì)，其中100個蛋白質(zhì)具有定量信息，初步實現(xiàn)了對誘導前后家蠅幼蟲血淋巴中差異蛋白的鑒定，為更多昆蟲功能蛋白的篩選和鑒定奠定了基礎。2、本研究通過對誘導后差異蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的理化性質(zhì)分析、GO注釋和KEGG代謝通

7、路分析展示了參與家蠅幼蟲免疫防疫的活性蛋白分子的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分布、GO注釋特征和代謝網(wǎng)絡。3、針刺誘導后鑒定的差異蛋白在蛋白表達水平和mRNA表達水平均有顯著變化，而熱誘導后僅在蛋白水平的表達有顯著變化，在mRNA水平表達變化較小，說明家蠅幼蟲可能在面對不同的環(huán)境脅迫時啟動的防御機制有所不同。4、本研究中鑒定到了多種抗菌多肽，如抗真菌肽，天蠶素2，攻擊素，雙翅肽等，其中雙翅肽的表達水平在蛋白水平和mRNA水平均有顯著上調(diào)，說明家蠅幼蟲