體外構(gòu)建雙高動子SECs及其對HepG2細胞端粒酶活性的干擾作用.pdf

1、中圖分類號＆2三：3UDC610碩士學位論文學校代碼!Q5三3密級公玨體外構(gòu)建雙啟動子SECs及其對HepG2細胞端粒酶活性的干擾作用ConstructionofdualpromotersSECsinvitroanditsinerfering：ffectlomeraseactivi白inHepG2cellsnterteringeftectontelomeraseactivityinHep(52cells1作者學科研究學院(指導名：業(yè)：向

2、：、所)：師：龔霞臨床醫(yī)學臨床檢驗診斷學醫(yī)學檢驗系彭劍雄副教授論文答辯日期_噬5、一答辯委員會主席中南大學2014年5月姓專方系教體外構(gòu)建雙啟動子SECs及其對HepG2細胞端粒酶活性的干擾作用摘要目的：構(gòu)建針對端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)基因的H1／U6雙啟動子表達框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)并研究其轉(zhuǎn)錄生成的siRNA／mi

3、RNA對人肝癌細胞(HepG2)端粒酶活性的干擾作用，以確定siRNA／miRNA表達載體的有效性，探索制備干擾性RNA的新途徑，從而為人類腫瘤的治療提供新方法。方法：利用融合PCR技術(shù)，針對人端粒酶hTERT基因開放閱讀區(qū)1800—1818和26502668位點構(gòu)建2條H1／U6雙啟動子SECs，針對其37端非翻譯區(qū)3878—3896和39643982位點構(gòu)建2條H1／U6雙啟動子SECs，并構(gòu)建一隨機序列干擾片段為對照。利用陽離子聚

4、合物轉(zhuǎn)染試劑以及磷酸鈣共沉淀法兩種方法分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)錄生成siRNA或miRNA。利用TRAP。PCR一銀染法檢測端粒酶活性，并對其電泳條帶進行灰度掃描，計算端粒酶活性抑制率；用SYBRGreenI熒光定量法直接定量端粒酶活性，分析H1／U6雙啟動子SECs對HepG2細胞端粒酶活性的干擾作用。結(jié)果：25％的瓊脂糖凝膠電泳分析以及測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了針對端粒酶hTERT的H1／U6雙啟動子SECs。與對照組相比，針對不同位

5、點的SECs的各轉(zhuǎn)染組，端粒酶活性出現(xiàn)不同程度的抑制。采用陽離子聚合物轉(zhuǎn)染法，針對位點1800—1818、2650—2668、38783896和3964—3982的各轉(zhuǎn)染組細胞端粒酶活性抑制率分別為4238％、6180％、7795％、7951％；采用磷酸鈣共沉淀法各轉(zhuǎn)染組細胞端粒酶活性抑制率分別為2019％、2738％、4253％、643％。結(jié)論：利用融合PCR成功構(gòu)建了SECs，并且其對HepG2細胞端粒酶hTERT基因表達有明顯的干