藥物L-NAME預處理誘導第二窗心肌保護作用的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 體外循環(huán)的發(fā)明使心臟外科的發(fā)展出現(xiàn)了一個新的飛躍,心臟外科醫(yī)生可以在一個無血、安靜的手術(shù)野里,對心臟的畸形和病變進行有效的治療和處理,但是由于主動脈的阻斷,心臟處于一個缺血、停跳的狀態(tài),手術(shù)中必須對心臟采取一個有效的保護措施,使心臟避免或減少由于缺血/再灌注引起的損傷。應用低溫使心臟氧需減少及含鉀液體灌注使心臟電機械停博是心肌保護的里程碑。上世紀80年代開始應用含血停跳液,對于保護心肌功能和減少心肌酶的釋放優(yōu)于

2、冷晶體停跳液。目前心肌保護液層出不窮,但是仍然表現(xiàn)出不同的缺陷,對心肌的保護不夠理想,體外循環(huán)時間一旦過長,手術(shù)的危險性成倍增加。如何減輕心肌缺血/再灌注損傷成為一個重要的臨床問題,越來越受到心臟外科醫(yī)生和體外循環(huán)灌注師的重視。但長期以來,心臟外科對心肌保護的方法都是外源性的。最近,有些學者開始注意研究內(nèi)源性保護機制,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)提高了心肌細胞自身對缺血、缺氧的耐受能力。缺血預處理是目前公認的最強的內(nèi)源性心肌保護措施,但其確切機制尚未清楚

3、,在臨床應用中亦存在諸多不便。人們在缺血預處理研究基礎之上,嘗試利用藥物模擬這種內(nèi)源性抗損傷能力,從而達到心肌保護效果,稱為藥物預處理。藥物預處理已經(jīng)成為心肌保護研究的熱點,研究表明許多藥物如腺苷、單磷酰酯A、K-ATP通道開放劑、吸入性麻醉藥和阿片類麻醉藥等均可以模擬缺血預處理產(chǎn)生心臟保護作用。動物試驗大多證實藥物預處理的心肌保護作用，但是人們應用動物實驗有效地預處理方法進行臨床試驗，沒有得到滿意的結(jié)果。原因可能是多方面，重要的原因是

4、大部分藥物預處理確切作用機制仍不清楚，以及缺乏必要的藥理學研究和大組隨機、雙盲、對照、多中心的臨床觀察結(jié)果，因而目前尚無一種模擬預處理的藥物獲準注冊進入臨床，如何獲得安全、高效、適于預處理臨床應用的藥物仍有待進一步研究和探索。由于藥物預處理模型有較好的可控性、重復性，且藥物預處理無明顯毒副作用及創(chuàng)傷性，血流動力學改變輕微而實驗對象易于耐受，故有利于預處理的實際推廣應用。深入研究藥物預處理的心肌保護作用機制，有利于探討心肌內(nèi)源性保護的病理

5、生理機制。隨著缺血預處理機制的進一步闡明，藥物預處理具有廣闊的臨床應用前景。
　　 我們先前的研究已經(jīng)證實在心肌遭受缺血冷停跳之前24小時，由大鼠腹腔注入L-精氨酸和NO合成酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)，取得了模擬心肌缺血預處理第二窗的心肌保護作用，在心肌保護液的應用基礎上進一步改善了各種心臟功能，但這種保護作用取得的機理尚不十分清楚，實驗中發(fā)現(xiàn)：冠狀靜脈竇流出液中的處理組腺苷水平較對照組明顯升高，cGMP水平在L

6、-NAME組明顯升高，L-NAME組的心肌保護作用最強。本課題擬深入研究藥物L-NAME預處理誘導第二窗的心肌保護作用機制，有望對心肌缺血/再灌注損傷的防治提供新的理論和方法，更好地在手術(shù)中保護心肌功能。
　　 目的：
　　 1.藥物L-NAME預處理誘導出的第二窗心肌保護作用，是否可疊加在冷停跳液提供的保護作用上再增強其保護作用。
　　 2.在藥物L-NAME預處理誘導的第二窗心肌保護啟動前給予腺苷A1受體拮抗

7、劑DPCPX，探討其對第二窗心肌保護作用的影響，明確腺苷受體激活是否為藥物預處理后心肌保護的啟動因子。
　　 材料和方法
　　 1.將體重250-320克30只雄性SD大鼠分成3組,每組10只:(1)缺血對照組:腹腔注射1ml生理鹽水,24h后建立離體大鼠心臟Langendorff罐注模型；(2)L-NAME預處理組:腹腔內(nèi)注射L-NAME(10mg/kg),24h后建立離體大鼠心臟Langendorff灌注模型；(3)

8、拮抗劑組:腹腔注射DPCPX(0.1mg/kg),30min后注射L-NAME(10mg/kg),24h后建立離體大鼠心臟Langendorff灌注模型。
　　 2.大鼠稱重后,給予戊巴比妥鈉(60mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉,肝素(1000U/kg)經(jīng)舌下靜脈注射進行抗凝,快速開胸取出心臟,立即將心臟放入4℃K-H液中,插入主動脈插管,迅速移至Langendorff灌注裝置上,用37℃K-H液(用95％O2和5％CO2持續(xù)平衡)

9、灌注,灌注壓維持在100cmH2O。肺動脈根部切開,使冠狀動脈回流液引流充分。灌注1min后切開左心耳,經(jīng)左心房、二尖瓣,將帶有測壓導管的心室球囊送入左心室,測壓導管的另一端接壓力換能器并與Pc-labue生物醫(yī)學信號采集處理系統(tǒng)相連接。向心室球囊內(nèi)緩慢注射適量蒸餾水,使左室舒張末壓(LVEDP)維持在10mmHg。K-H液灌注穩(wěn)定15min后,經(jīng)主動脈根部灌注10ml 4℃ St Thomas’Ⅱ停跳液,所有的心臟于20℃停跳60mi

10、n(模擬手術(shù)中心臟停跳過程),而后再用K-H液灌注120min。在穩(wěn)定末期只有滿足下列條件:HR 240-360 beats/min,LVDP 60-130mmHg,CF 8-16 ml/min才納入實驗。
　　 3.實驗中于灌注穩(wěn)定15min、再灌注1min、再灌注60min、再灌注120min四個時間點用Pc-labue生物醫(yī)學信號采集處理系統(tǒng)記錄HR、LVDP,通過冠脈流出量及時間計算CF,同時收集冠脈流出液放于-20℃冰

11、箱,備Siemens全自動化學發(fā)光免疫分析儀檢測cTnI。實驗結(jié)束時取左心室游離壁心肌用電鏡固定液處理后在PHILIPS CM 10透射電鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 結(jié)果
　　 1.血流動力學:全組心率(HR)缺血前無差別,拮抗劑組缺血后心率較L-NAME組慢,有顯著性差異(P<0.05),與缺血對照組無差別；左室發(fā)展壓(LVDP)是心肌收縮壓與舒張壓之差,反映心肌的舒縮功能,拮抗劑組的LVDP較L-NAME預處理

12、組低,有顯著性差異(P<0.05),與缺血對照組無差別；冠脈流量(CF)反映冠脈血管阻力和心肌氧供情況,拮抗劑組的CF較L-NAME預處理組少,有顯著性差異(P<0.05),與缺血對照組無差別。
　　 2.心肌酶:cTnI具有心肌特異性,對心肌損傷比其他心肌酶具有更高的敏感性和特異性,拮抗劑組的cTnl較L-NAME預處理組顯著增高(P<0.05),與缺血對照組無差別。
　　 3.心肌超微結(jié)構(gòu)改變:電鏡下缺血對照組及拮抗

13、劑組心肌細胞水腫明顯,胞核不規(guī)則,染色體邊集,線粒體腫脹,部分嵴模糊、空泡變,肌絲溶解,肌漿網(wǎng)擴張；L-NAME預處理組心肌細胞及間質(zhì)輕度水腫,肌質(zhì)纖維排列較整齊,肌絲清晰,線粒體輕度腫脹,部分嵴稍模糊,核染色體均勻。拮抗劑組及缺血對照組心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷程度較L-NAME預處理組重。
　　 結(jié)論
　　 1.藥物L-NAME誘導出的第二窗心肌保護作用,可疊加在原有心肌保護液提供的保護作用之上再增強其保護作用。