急性心肌梗死相關(guān)性肺部炎癥反應(yīng)的初步探討.pdf

1、研究背景:
　　急性心肌梗死是臨床上常見(jiàn)的急危重癥，可誘導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。這不僅出現(xiàn)在心臟本身，也出現(xiàn)在肺部，其急性期主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞和炎癥因子在肺部浸潤(rùn);然后逐漸出現(xiàn)膠原纖維的過(guò)量積聚。目前AMI對(duì)肺臟的影響研究較少。
　　樹(shù)突狀細(xì)胞是功能最強(qiáng)和唯一能誘導(dǎo)機(jī)體初始免疫應(yīng)答的抗原遞呈細(xì)胞，能夠啟動(dòng)和維持組織器官的炎癥反應(yīng)。成熟DCs遞呈外來(lái)或自身抗原并激活T細(xì)胞，啟動(dòng)或維持炎癥反應(yīng)，但其在心肌梗死所致肺部炎癥和纖維化中的作

2、用尚未明確。
　　本課題首先通過(guò)建立小鼠急性心肌梗死模型，探討急性心肌梗死對(duì)肺臟的影響。進(jìn)一步通過(guò)T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DCs的免疫調(diào)節(jié)功能，探討DCs在急性心肌梗死引起肺臟改變中可能的作用。
　　第一部分急性心肌梗死相關(guān)性肺部炎癥反應(yīng)
　　目的:
　　通過(guò)建立小鼠急性心肌梗死模型，探討急性心肌梗死對(duì)肺臟的影響。
　　方法:
　　(1)通過(guò)結(jié)扎左冠脈前降支建立小鼠急性心肌梗死模型，在1周及2周后行心超檢測(cè)

3、及血清BNP水平。
　　(2)分組:對(duì)照組（Sham組），急性心梗后1周組（MW1組）;急性心梗后2周組（MW2組）。
　　(3)分別在1周及2周后檢測(cè)以下指標(biāo):①肺泡灌洗液細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)和肺濕干重比;②肺組織HE染色、Masson染色及TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;③肺組織中ACE、CD11c、CD68、α-SMA、TLR4、TLR9的免疫組化檢測(cè);④采用CBA法，檢測(cè)血漿和BALF中IL-6、MCP-1、IL-12p70、TN

4、F-α、IL-10水平;⑤采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺組織單細(xì)胞懸液中CD45、CD11c及TLR9陽(yáng)性的細(xì)胞比例。
　　結(jié)果:
　　在急性心肌梗死后1周時(shí)，血漿中IL-6、MCP-1、IL-12p70、TNF-α、IL-10水平較Sham組顯著增高(p＜0.05)。Sham組BALF中的細(xì)胞數(shù)量少，分類(lèi)以巨噬細(xì)胞為主;MW1組的中性粒細(xì)胞明顯增加(p＜0.05)。IL-6、IL-12p70水平也顯著升高(p＜0.05)。肺組織也出

5、現(xiàn)系列改變，其中HE染色顯示:MW1組小鼠肺組織充血、肺泡腔內(nèi)有滲出液、肺泡間隔明顯增厚、肺間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、毛細(xì)血管擴(kuò)張充血;肺內(nèi)凋亡細(xì)胞明顯增加(p＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，ACE、CD11c、CD68、α-SMA、TLR4、TLR9表達(dá)較Sham組顯著增加(p＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺組織單細(xì)胞懸液中TLR9陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加(p＜0.05)。Masson染色顯示，肺內(nèi)已出現(xiàn)纖維組織增生，肺濕/干重比(W/D)下降(

6、p＜0.05)。
　　在急性心肌梗死后2周時(shí)，血漿中IL-6、MCP-1、IL-12p70、TNF-α、IL-10水平仍持續(xù)顯著增高(p＜0.05)。BALF中性粒細(xì)胞仍增加明顯(p＜0.05); IL-6、MCP-1、IL-12p70、TNF-α、IL-10水平均顯著升高(p＜0.05)。肺組織HE染色示MW2組小鼠肺組織較MW1組充血水腫明顯減輕、炎癥細(xì)胞減少，但肺間質(zhì)明顯增厚。肺內(nèi)凋亡細(xì)胞增加明顯(p＜0.05)。免疫組化結(jié)

7、果顯示，ACE、CD11c、CD68、α-SMA仍有上升趨勢(shì)(p＜0.05)。TLR4、TLR9無(wú)明顯變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺組織單細(xì)胞懸液中CD45、CD11c及TLR9陽(yáng)性的細(xì)胞顯著增多(p＜0.05)。Masson染色顯示，肺間質(zhì)、支氣管及肺血管周?chē)w維化更顯著(p＜0.05)。肺濕/干重比(W/D)顯著下降(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)急性心肌梗死后1周，肺組織出現(xiàn)了以炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子增加為主的急性炎

8、癥反應(yīng)。
　　(2)急性心肌梗死后2周時(shí)，肺部炎癥反應(yīng)仍持續(xù)存在，但更為顯著的變化是肺間質(zhì)、支氣管及肺血管周?chē)睦w維化。
　　第二部分心肌壞死物激活樹(shù)突狀細(xì)胞的炎癥反應(yīng)
　　目的:
　　探討DCs在急性心肌梗死后肺部炎癥反應(yīng)中可能起到的作用。
　　方法:
　　(1)分組:對(duì)照組（CONTR組）;干預(yù)組（MEDIUM組）
　　(2)將壞死心肌細(xì)胞的上清加入小鼠骨髓源性DCs中培養(yǎng)，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變

9、化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD83、CD86，CBA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ水平，Western Blot法檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)。
　　(3)從小鼠脾臟獲取CD4+T細(xì)胞，并與干預(yù)后的DCs共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞的增殖水平。
　　結(jié)果:
　　(1)將小鼠骨髓源性DCs加入GM-CSF和IL-4培養(yǎng)后，細(xì)胞呈半懸浮樣生長(zhǎng)，突起明顯，胞體變大，形態(tài)不規(guī)則。加入壞死心肌細(xì)胞的上清

10、培養(yǎng)后，DCs的突起明顯增多、變長(zhǎng)。
　　(2)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DCs加入壞死心肌細(xì)胞的上清培養(yǎng)后，對(duì)CD80和CD83分子具有明顯的上調(diào)作用(p＜0.05)，而對(duì)CD40、CD86和MHC-Ⅱ并無(wú)上調(diào)作用，其中，對(duì)CD40有抑制趨勢(shì)。
　　(3)培養(yǎng)上清的細(xì)胞因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNF-α、IFN-γ水平較對(duì)照組顯著升高(p＜0.05)。
　　(4) Western Blot檢測(cè)NF-κB表達(dá)結(jié)果提示，MEDIUM組N