TGF-β1和LPA增強(qiáng)整合素β6基因啟動(dòng)子在肝癌細(xì)胞Hep-3B中的轉(zhuǎn)錄活性.pdf

1、研究目的:
　　本研究主要探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子–β1(Transforming Growth Factor–β1,TGF-β1)和溶血磷脂酸(Lysophosphatidic Acid,LPA)是否能誘導(dǎo)整合素αvβ6(Itgαvβ6)在肝癌細(xì)胞Hep3B2.1-7(Hep-3B)中過度表達(dá),并對(duì)整合素β6(Itgβ6)基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行初步研究。
　　材料與方法:
　　首先,臨床上收集肝癌患者的組織標(biāo)本,每例標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)

2、切片,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Itgαvβ6的表達(dá)水平。然后,培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞Hep-3B,采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法檢測(cè)其是否表達(dá)Itgαvβ6。再分別用TGF-β1或/和LPA刺激Hep-3B細(xì)胞,利用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)方法檢測(cè)Hep-3B中Itgαvβ6的mRNA表達(dá)水平,利用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)方法檢測(cè)Hep-3B中Itgαvβ6的蛋白表達(dá)水平;同時(shí),利用Itgβ6基因轉(zhuǎn)錄起

3、始位點(diǎn)附近1135bp基因序列經(jīng)PCR進(jìn)行不同長(zhǎng)度的缺失擴(kuò)增,并連接到載體質(zhì)粒pGL2-basic,構(gòu)建重組質(zhì)粒,利用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子區(qū)在TGF-β1和LPA誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄活力,最后利用Transcription Element Search System(TESS)預(yù)測(cè)Itgβ6基因主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組織化學(xué)檢測(cè):整合素αvβ6在肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本中呈高表達(dá),而

4、在正常肝臟組織中并不表達(dá)。
　　2.RT-PCR檢測(cè):Hep-3B細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ6,在正常肝細(xì)胞(HL-7702)卻未發(fā)現(xiàn)表達(dá)。
　　3.Real-timePCR檢測(cè):TGF-β1、LPA和TGF-β1+LPA均可誘導(dǎo)Hep-3B細(xì)胞過度表達(dá)整合素αvβ6:TGF-β1刺激組整合素αvβ6在mRNA水平的表達(dá)(1.947±0.1953)較對(duì)照組(1.041±0.1029)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);LPA刺激組

5、整合素αvβ6在mRNA水平的表達(dá)(2.085±0.2046)較對(duì)照組(1.041±0.1029)增加,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01);TGF-β1+LPA刺激組整合素αvβ6在mRNA水平的表達(dá)(4.717±0.2759)較對(duì)照組(1.041±0.1029)增加,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　4.WesternBlot檢測(cè):以GAPDH作為內(nèi)參基因,TGF-β1刺激組整合素αvβ6在蛋白質(zhì)水平(2.680±0.152

6、4)較對(duì)照組(1.000±0.07876)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);LPA刺激組整合素αvβ6在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)(2.764±0.1313)較對(duì)照組(1.000±0.07876)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);TGF-β1+LPA刺激組整合素αvβ6在蛋白質(zhì)水平(4.293±0.3847)較對(duì)照組(1.000±0.07876)增加,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　5.質(zhì)粒構(gòu)建:重組質(zhì)粒pGLB-100、pGL

7、B-207、pGLB-359、pGLB-630、pGLB-1135、pGLB-A、pGLB-B和pGLB-C經(jīng)DNA測(cè)序報(bào)告顯示與Genbank中序列完全吻合。
　　6.雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)檢測(cè):重組質(zhì)粒pGL2-Basic、pGLB-100、pGLB-207、pGLB-359、pGLB-630和pGLB-1135在Hep-3B細(xì)胞中的活性分別為0.1572±0.01142,0.1787±0.02194,0.3786±0.0

8、4136,1.078±0.08542,2.175±0.2625,1.000±0.09335(pGLB-1135的熒光值為1);在-458/-187這個(gè)區(qū)域,啟動(dòng)子活性明顯下降。對(duì)458/-187這個(gè)區(qū)段的基因序列進(jìn)行亞克隆,再構(gòu)建三個(gè)質(zhì)粒,分別命名為pGLB-A、pGLB-B和pGLB-C,3種重組質(zhì)粒在Hep-3B細(xì)胞中的活性分別為:111.996±3.185,84.627±2.551,105.875±1.310。重組質(zhì)粒pGLB-C

9、的活性較pGLB-A無(wú)明顯改變,故-326bp/-157bp區(qū)為整合素β6基因啟動(dòng)子的主要調(diào)控區(qū)。
　　7.(TESS)在線預(yù)測(cè):-326bp/-157bp區(qū)之間序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,在該區(qū)域潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)有:AP-1、c-Myb、HNF-1/HNF-1B、SRF和YY1。
　　8.TGF-β1和LPA增強(qiáng)整合素β6基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性:在TGF-β1或LPA的刺激下,重組質(zhì)粒pGLB-C在Hep-3B細(xì)胞中的活