Chemerin其受體ChemR23對高糖誘導的腎小球內皮細胞炎癥反應的調控作用.pdf

1、背景：
　　糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）已經成為世界范圍內導致終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）最為重要的原因之一。腎小球內皮細胞（glomerular endothelial cell，GEnC）是腎小球濾過屏障必不可少的組成成分，其對于限制蛋白尿的產生，維持正常腎功能均具有重要的意義。研究發(fā)現，高糖環(huán)境可誘導腎小球內皮細胞發(fā)生明顯的炎癥反應，引起相應的功能障礙

2、。探討內皮細胞炎癥反應的發(fā)生原因對DN發(fā)病機制的理解及臨床治療具有重要意義。
　　Chemerin是1997年發(fā)現的一種脂肪因子，在體內多種細胞均有表達，且與脂質代謝、炎癥反應、免疫調節(jié)等密切相關。其分泌入血后具有調節(jié)全身及局部炎癥反應并誘導白細胞趨化的作用。ChemR23是最主要的識別Chemerin的受體。研究證實 Chemerin主要通過ChemR23激活細胞內多種信號通路，引起下游炎癥因子的轉錄，造成組織炎性損傷。但目前為

3、止，二者在DN腎小球內皮細胞炎癥反應中的作用尚未明確。
　　目的：
　　1.觀察高糖環(huán)境下小鼠腎小球內皮細胞Chemerin、ChemR23及炎癥因子TNF-α、IL-6表達變化。
　　2.沉默Chemerin受體ChemR23的表達后應用Chemerin刺激細胞，觀察炎癥因子TNF-α、IL-6的表達變化。
　　3.沉默Chemerin受體ChemR23的表達后，觀察高糖誘導下炎癥因子TNF-α、IL-6的表達

4、變化。
　　4.通過抑制p38 MAPK的磷酸化，觀察炎癥因子TNF-α、IL-6的表達變化。
　　方法：
　　以條件永生化小鼠GEnCs為研究對象
　　1.體外培養(yǎng)小鼠GEnCs并分成四組：正常對照組（葡萄糖：5.6mmol/L）、20mmol/L高糖組、40mmol/L高糖組、滲透壓對照組（5.6mmol/L葡萄糖＋34.4mmol/L甘露醇），不同培養(yǎng)基作用24h后進行檢測。Western Blot檢測細胞

5、Chemerin、ChemR23、TNF-α、IL-6蛋白的表達水平，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α、IL-6的表達水平，qRT-PCR檢測細胞Chemerin、ChemR23、TNF-α、IL-6的mRNA表達水平。
　　2.構建針對ChemR23的慢病毒載體，將慢病毒載體和空載體分別轉染入小鼠GEnCs后，給予Chemerin刺激，共分為四組：正常對照組、Chemerin刺激組、Chemerin＋空載體組、Ch

6、emerin＋shRNA干擾組。培養(yǎng)一定時間后進行檢測。Western Blot檢測ChemR23蛋白表達水平，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清炎癥因子TNF-α、IL-6的表達水平，qRT-PCR檢測細胞TNF-α、IL-6的mRNA表達水平。
　　3.將慢病毒載體和空載體分別轉染入高糖下培養(yǎng)的小鼠GEnCs，共分為四組：正常對照組、高糖組、高糖＋空載體組、高糖＋shRNA干擾組。培養(yǎng)一定時間后進行檢測。ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清炎癥

7、因子TNF-α、IL-6的表達水平，qRT-PCR檢測細胞TNF-α、IL-6的mRNA表達水平，Western Blot檢測p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達水平。
　　4.體外培養(yǎng)小鼠GEnCs，高糖刺激前加入p38 MAPK抑制劑SB203580，共分為三組：正常對照組、高糖組、高糖＋抑制劑組。培養(yǎng)一定時間后，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清炎癥因子TNF-α、IL-6的表達水平，qRT-PCR檢測細胞TNF-α、IL

8、-6的mRNA表達水平。
　　結果：
　　1.高糖環(huán)境下小鼠GEnCs中Chemerin、ChemR23及炎癥因子IL-6、TNF-α的表達變化。
　　與正常對照相比，高糖組GEnCs中炎癥因子IL-6及TNF-α的表達顯著升高（P<0.05），同時Chemerin表達水平明顯升高（P<0.05），但ChemR23表達無明顯變化（P>0.05），滲透壓對照組均無改變（P>0.05）。
　　2.慢病毒載體干擾Che

9、mR23表達后Chemerin作用下小鼠GEnCs中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達變化。
　　使用針對ChemR23的shRNA慢病毒干擾ChemR23表達后應用 Chemerin刺激細胞，Chemerin刺激組IL-6及TNF-α表達明顯升高（P<0.05），與Chemerin+空載體組相比，Chemerin+shRNA干擾組IL-6及TNF-α水平明顯下降（P<0.05）。
　　3.慢病毒載體干擾ChemR23表達后

10、高糖誘導下小鼠GEnCs中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達變化和p38 MAPK信號通路的活化情況。
　　干擾ChemR23表達后，與高糖+空載體組相比，高糖+shRNA干擾組IL-6及TNF-α水平明顯下降（P<0.05）。高糖組p38 MAPK磷酸化水平明顯升高（P<0.05），提示p38 MAPK活化增強。與高糖+空載體組相比，高糖+shRNA干擾組p-p38MAPK水平顯著降低（P<0.05）。
　　4.使用p38

11、 MAPK特異性抑制劑SB203580，小鼠GEnCs中的炎癥因子IL-6、TNF-α的表達變化。
　　與高糖組相比，高糖+抑制劑組IL-6及TNF-α水平顯著降低（P<0.05）。
　　結論：
　　1.高糖刺激可誘導GEnCs合成Chemerin。
　　2.Chemerin通過結合其受體ChemR23可引起p38 MAPK信號通路的活化，從而誘導炎癥因子IL-6及TNF-α等的表達，促進GEnCs的炎癥反應。<