角膜環(huán)狀皮樣瘤致病基因PITX2 R62H突變體的功能研究.pdf

1、角膜環(huán)狀皮樣瘤是一種十分罕見的先天性良性腫瘤，呈常染色體顯性遺傳，雙眼發(fā)病，為環(huán)形淡黃色或灰白色的實性腫物，一般侵及角膜實質淺層，多位于角膜緣處，可延伸到角膜和結膜，患者可出現(xiàn)視力的改變，如不規(guī)則散光、弱視和斜視。在組織學上腫塊由不同比例的外胚層包括角化的上皮、頭發(fā)、皮脂腺和中胚層包括纖維組織、脂肪組織、血管組成。2004年，中南大學醫(yī)學遺傳學國家重點實驗室采用定位候選克隆策略從一個遺傳了四代共55人的角膜環(huán)狀皮樣瘤家系中克隆了該病的致

2、病基因PITX2。家系中的所有患者都攜帶PITX2基因的G185A突變，家系中以及無血緣關系的正常人都不帶有這種突變，證明在這個家系中PITX2G185A突變是造成角膜環(huán)狀皮樣瘤的原因。 PITX2是屬于Bicoid同型盒家族的轉錄因子，并且與另外兩種高度同源的轉錄因子PITX1和PITX3構成PTX亞家族。PITX2是脊椎動物心臟和腸道系統(tǒng)發(fā)育的重要調節(jié)因子，也是介導左右不對稱發(fā)育的信號分子，基因剔除小鼠模型顯示PITX2功能

3、的缺失會導致胚胎多器官多形態(tài)的異常，并且在胚胎期致死。PITX2的突變可以引發(fā)多種遺傳性疾病。 PITX2G185A突變導致編碼產物Arg62His(R62H)的改變。本文用overlapPCR的方法定點引入G185A突變到野生型PITX2cDNA中，并克隆到不同的真核表達載體。用PITX2-GFP融合載體瞬時轉染HeLa細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察GFP綠色熒光來了解PITX2的定位，用PITX2-myc重組載體瞬時轉染HeLa

4、細胞和COS-7細胞，制備核蛋白進行WesternBlot分析，結果顯示R62H突變體表現(xiàn)出完全的細胞核定位，重組蛋白在不同的真核細胞中都能穩(wěn)定表達，并且大小沒有改變。用放射性同位素標記的CE-3寡核苷酸探針與PITX2蛋白共孵育后進行電泳遷移率變動分析，R62H突變體能夠與標記探針特異性結合，并且結合能力與野生型沒有差異。構建CE3-pGL3-promoter熒光素酶報告載體，與PITX2-myc共轉HeLa細胞，熒光素酶活性分析顯示

5、R62H突變體的轉錄激活能力有小幅降低。用流式細胞儀分析穩(wěn)定轉染PITX2的HeLa單克隆的細胞周期，R62H突變體延緩細胞進入S期，但是促進細胞從S期→G2/M期的轉換。我們推測R62H轉錄激活能力的降低是造成細胞周期改變和角膜環(huán)狀皮樣瘤的原因。 本文還引入了另外兩種導致遺傳病的PITX2突變，即與AxenfeldRieger綜合征相關的T68P和與虹膜發(fā)育不良相關的R84W，對這兩種突變體功能分析的結果與其他研究者的報道一致