PPARα激動(dòng)劑對(duì)2型糖尿病不同發(fā)展階段實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型胰島β細(xì)胞功能的影響及其機(jī)理研究.pdf_第1頁(yè)
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1、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPARα主要激活與脂肪酸氧化代謝相關(guān)基因的表達(dá),其調(diào)控作用與代謝性疾病如高脂血癥、糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此,PPARα激動(dòng)劑——貝特類藥物的主要臨床應(yīng)用是降低血清甘油三酯和升高HDL-C,用于高血脂或2型糖尿病患者脂質(zhì)代謝紊亂的治療。近年國(guó)內(nèi)外學(xué)者在基礎(chǔ)和臨床范圍對(duì)貝特類藥物在脂質(zhì)代謝以外的藥理作用做了大量的研究工作,一些研究發(fā)現(xiàn)該類藥物還能改善血管內(nèi)皮功能、緩解機(jī)體炎癥狀態(tài),并通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝增強(qiáng)機(jī)體

2、胰島素敏感性,進(jìn)而緩解胰島β細(xì)胞的代償性分泌壓力,因而可能具有延緩糖尿病及相關(guān)心血管疾病發(fā)生發(fā)展作用。本實(shí)驗(yàn)室在研究調(diào)脂類藥物對(duì)脂質(zhì)代謝異常、2型糖尿病以及與胰島素抵抗相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)及治療作用方面有著豐富的實(shí)驗(yàn)積累,在一次評(píng)價(jià)幾種PPAR激動(dòng)劑(包括PPARγ激動(dòng)劑、PPARα激動(dòng)劑、PPARα/γ雙激動(dòng)劑)對(duì)胰島素抵抗動(dòng)物模型胰島素敏感性影響時(shí)發(fā)現(xiàn),PPARα激動(dòng)劑非諾貝特(fenofibrate)在沒(méi)有明顯改善動(dòng)物胰島素敏感性的情況

3、下,使動(dòng)物血胰島素水平顯著降低。該發(fā)現(xiàn)提醒我們PPARα激動(dòng)劑是否可能對(duì)β細(xì)胞的胰島素分泌功能存在直接的影響,從而導(dǎo)致血清胰島素水平的下降?究竟長(zhǎng)期使用PPARα激動(dòng)劑是有益于還是有損于β細(xì)胞的功能?這類藥物又是如何導(dǎo)致β細(xì)胞功能的變化?由于該類藥臨床常用于2型糖尿病且伴有高甘油三酯血癥患者的長(zhǎng)期治療,因此,考察該類藥物對(duì)胰島β細(xì)胞功能的影響意義深遠(yuǎn)、值得深入探討。
   本課題的開展就是建立在這些問(wèn)題之上,通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)

4、并解釋PPARα激動(dòng)劑對(duì)胰島β細(xì)胞功能產(chǎn)生的影響及其可能作用機(jī)制。我們選擇兩種臨床常用的PPARα激動(dòng)劑非諾貝特和吉非羅齊(gemfibrozil)作為受試藥物,用幾種處于糖尿病發(fā)展不同階段的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,其狀態(tài)從正常(ICR小鼠)→代謝綜合征(MSG肥胖大鼠)→肥胖性胰島素抵抗的2型糖尿病(高脂喂養(yǎng)C57小鼠),依次加重,甚至包括老年的肥胖性胰島素抵抗動(dòng)物模型(14月齡高脂喂養(yǎng)C57小鼠),研究?jī)煞NPPARα激動(dòng)劑在糖尿病發(fā)展不同階段

5、中對(duì)胰島β細(xì)胞功能的影響,探討β細(xì)胞功能變化的分子機(jī)制,并分析這種作用是否依賴于機(jī)體所處的狀態(tài)。以期為PPARα激動(dòng)劑在臨床廣泛用于高血脂癥、2型糖尿病患者的合理應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
   論文的第一部分在本實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和技術(shù)條件等工作基礎(chǔ)上,成功建立了評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞功能常用兩種實(shí)驗(yàn)技術(shù)及方法--原代胰島分離培養(yǎng)方法和高葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)技術(shù),另外,也包括用于評(píng)價(jià)機(jī)體胰島素敏感性的正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)??捎糜隗w、內(nèi)外評(píng)價(jià)和考察胰島β

6、細(xì)胞的胰島素分泌功能及胰島的病理生理改變。本部分研究選擇正常大、小鼠和幾種本實(shí)驗(yàn)室常用的2型糖尿病模型動(dòng)物,確定了高胰島素-正葡萄糖鉗夾和高葡萄糖鉗夾的一般步驟及試驗(yàn)參數(shù)條件,并考察了該評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性和可靠性;原代胰島分離及培養(yǎng)方法的建立為今后體外胰島β細(xì)胞功能評(píng)價(jià)及藥物作用機(jī)制研究提供較好的實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)。目前,已將這兩種方法分別用于抗糖尿病候選化合物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)及本課題后續(xù)的藥物作用機(jī)制研究。
   論文的第二部分著重探討了

7、非諾貝特(Fen)和吉非羅齊(Gem)對(duì)2型糖尿病發(fā)展不同階段動(dòng)物模型胰島β細(xì)胞功能的影響,包括正常ICR小鼠、代謝綜合征動(dòng)物模型MSG大鼠、2型糖尿病動(dòng)物模型高脂喂養(yǎng)C57小鼠以及老年高脂喂養(yǎng)C57小鼠模型。研究?jī)?nèi)容包括兩種PPARα激動(dòng)劑對(duì)血脂異常、胰島素敏感性和胰島β細(xì)胞的胰島素分泌功能的影響,并進(jìn)一步探尋藥物作用后可能影響p細(xì)胞功能的多種相關(guān)因素、重要因子發(fā)生的改變。在研究中發(fā)現(xiàn),在幾種動(dòng)物模型中Fen和Gem除可以調(diào)節(jié)血脂紊亂

8、、一定程度上改善胰島素敏感性外,對(duì)正常動(dòng)物、代謝綜合征動(dòng)物及2型糖尿病動(dòng)物模型的胰島素分泌均產(chǎn)生一定負(fù)調(diào)控作用。而在老年高脂喂養(yǎng)C57小鼠模型中,雖然鉗夾實(shí)驗(yàn)觀察Fen表現(xiàn)出一定程度改善胰島素分泌的作用,但其血清胰島素下降幅度與胰島素敏感性改善的相符關(guān)系也并不十分合理,這提示在該模型中Fen對(duì)胰島功能也存在一定的負(fù)調(diào)控作用。雖然,在幾種不同的動(dòng)物模型中Fen和Gem分別能夠不同程度地上調(diào)胰腺中糖脂代謝相關(guān)因子如GLUT2、GK及PPAR

9、α的基因表達(dá),也能一定程度上調(diào)胰島細(xì)胞增殖及胰島素信號(hào)通路相關(guān)因子如IRS2、PKB、GLP1R的基因表達(dá),甚至對(duì)胰島素生物合成、顆粒囊泡胞吐及離子通道蛋白如PDX1、INS1、SNAP25、Syntaxin1a、NCX1、SERCA2等基因有一定上調(diào)作用,并且這些作用均可能利于胰島β細(xì)胞的胰島素分泌功能。但是,在所有實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭幸舶l(fā)現(xiàn)一些共同存在的問(wèn)題是:PPARα激動(dòng)劑Fen和Gem均能夠顯著上調(diào)胰腺線粒體中解偶聯(lián)蛋白UCP2的表達(dá),

10、并且不同程度地增加胰腺及胰島細(xì)胞中核因子NF-κB及其上下游炎癥因子如TNFα、IL6、iNOS的基因或蛋白表達(dá)水平及酶活性。此發(fā)現(xiàn)提示貝特類藥物可能干擾胰島細(xì)胞中ATP的生成及引發(fā)胰腺炎癥通路活化,并且這兩種作用可能與該類藥物導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞功能紊亂存在較大的相關(guān)性。
   論文的第三部分主要選擇胰島瘤細(xì)胞株NIT-1,在體外考察了PPARα激動(dòng)劑Fen對(duì)NIT-1細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌的影響;另外,利用基因工程的方法構(gòu)建

11、轉(zhuǎn)染Peak-12-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒的NIT-1細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)情況考察Fen是否能夠活化胰島β細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活?并且通過(guò)使用PPARα阻斷劑探討該作用是否是依賴于PPARα的激活?結(jié)果顯示在Fen10-7M濃度下培養(yǎng)過(guò)夜的NIT-1細(xì)胞,其高糖刺激的胰島素分泌水平較正常對(duì)照組顯著降低,但其影響機(jī)制需后續(xù)研究證實(shí)是否如整體實(shí)驗(yàn)所述與UCP2蛋白表達(dá)水平有關(guān);而加入PPARα阻斷劑MK886(

12、10-6M)共孵育后能夠增加被Fen抑制的胰島素分泌,說(shuō)明阻斷PPARα后能夠促進(jìn)NIT-1細(xì)胞高糖刺激的胰島素分泌。另外發(fā)現(xiàn)Fen10-7M濃度培養(yǎng)過(guò)夜的NIT-1細(xì)胞中GFP表達(dá)水平升高,說(shuō)明Fen有活化NF-κB轉(zhuǎn)錄激活的作用,加入MK886拮抗PPARα的激活作用能夠一定程度抑制Fen作用后GFP的表達(dá)。此結(jié)果提示Fen在體外能夠活化胰島β細(xì)胞內(nèi)NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活作用,抑制高糖刺激的胰島素分泌,并且其作用可能依賴于PPARα的

13、激活作用。
   綜上所述,本文首先建立了體內(nèi)、體外胰島β細(xì)胞功能評(píng)價(jià)方法。從整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、體外細(xì)胞到分子水平研究了PPARα激動(dòng)劑類藥物對(duì)胰島β細(xì)胞功能的影響。最終發(fā)現(xiàn)從正常到2型糖尿病發(fā)生不同階段的動(dòng)物模型中,PPARα激動(dòng)劑Fen和Gem長(zhǎng)期給予能夠影響胰島β細(xì)胞的胰島素分泌功能,該作用與其一定程度活化胰腺中核因子NF-κB通路,上調(diào)線粒體ATP合成關(guān)鍵蛋白UCP2的表達(dá)有關(guān)。依據(jù)本課題研究中獲得的結(jié)果推測(cè),PPARα激動(dòng)

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