斑點雜交法在侵襲性煙曲霉菌感染診斷中的實驗及臨床研究.pdf

1、研究背景與目的 近幾年來隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，各種疾病的治療手段不斷創(chuàng)新，如造血干細胞移植術(shù)、器官移植術(shù)、腫瘤化療術(shù)及導(dǎo)管置管術(shù)的廣泛開展，廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，以及艾滋病人群的不斷增加，致使條件致病真菌感染率不斷上升。2003年北京協(xié)和醫(yī)院統(tǒng)計的侵襲性真菌感染（Invasive fungal infection，IFI）發(fā)生率是20世紀九十年代的3．6倍，哈爾濱血液病腫瘤研究所2004年報道的血液病IFI發(fā)生

2、率是上世紀末的4．0倍。目前臨床上常見的深部真菌是念珠菌、曲霉菌、新隱球菌等。念珠菌約占40％～70％，而近年來曲霉菌感染率比往年有明顯增高，在中性粒細胞缺乏和骨髓移植的患者中，侵襲性曲霉?。↖nvasive Aspergillus，IA）的感染率高達50％，是危害最大且預(yù)后最差的深部真菌感染，而且死亡率極高。其中煙曲霉是引起侵襲性曲霉菌感染中最常見而且致病性最強的菌種。 探索早期、特異、敏感的快速診斷方法一直是曲霉菌感染研究領(lǐng)

3、域的熱點和難點。傳統(tǒng)的診斷方法時間長，敏感性低，適用性差。目前人們把焦點集中到曲霉菌血清學(xué)和分子生物學(xué)的快速檢測兩個方面上。已有的血清學(xué)方法中，抗體檢測法因患者存在免疫抑制，使抗體水平低不能反映患者的感染情況而受到限制。血液中抗原檢測方法雖然有優(yōu)勢，但由于抗原量少以及方法學(xué)的不足未得到廣泛開展。最近出現(xiàn)的半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）抗原檢測的ELISA方法，具有很好的靈敏性，已在歐美國家廣泛開展，但其價格昂貴，在國內(nèi)

4、廣泛應(yīng)用有一定困難。另外，在中性粒細胞缺乏的血液病患者中，存在抗原遞呈功能和淋巴細胞功能損害，使得血清學(xué)試驗（如半乳甘露聚糖試驗等），喪失了診斷價值。 研究方法: 1．煙曲霉菌種特異性探針的制備： 真菌DNA的提?。篋NA的提取采用CTAB法。 煙曲霉種特異性探針（ALP）基因片段引物：上游引物5'-TCCGTGTACTTGATGGGTCT-3’下游引物5’-ATGTACGAGGATGTGAGCCG-3’

5、引物參照文獻報道的核苷酸序列。 PCR擴增ALP基因、產(chǎn)物分析與測序：ALP基因經(jīng)PCR擴增，擴增片段長度為465bp。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相后切膠回收純化，并進行測序，結(jié)果與GenBank提供的ALP基因文庫序列號進行對比以確定其基因來源。 2．探針的標記與斑點雜交： ALP基因片段經(jīng)PCR擴增后用隨機引物法進行地高辛標記，將煙曲霉、黃曲霉、念珠菌、隱球菌等真菌以及細菌DNA固定于帶正

6、電荷的尼龍膜上再與地高辛標記的探針行斑點雜交，雜交結(jié)果陽性，可確定有煙曲霉菌感染。 3．侵襲性煙曲霉菌動物感染模型的建立： 實驗分組：72只SD大鼠分為三組，實驗組48只，正常對照組及免疫抑制組各12只。 免疫抑制及感染模型的建立：將實驗組和免疫抑制對照組，分別給每只大鼠肌肉注射地塞米松0．6mg/kg，環(huán)磷酰胺75mg/kg，連續(xù)兩天。在免疫抑制后第3天，實驗組給予肌肉注射地塞米松0．6mg/kg后，將1×10

7、8/ml煙曲霉孢子混懸液緩慢滴入大鼠雙鼻孔內(nèi)，并使大鼠保持直立。每次滴入0．3～0．4 ml，1次/天，連續(xù)3天。免疫抑制對照組給予肌肉注射地塞米松0．6mg/kg，經(jīng)雙鼻孔滴入生理鹽水0．3～0．4 ml，1次/天，連續(xù)3天。 血清、肺泡灌洗液及內(nèi)臟標本的采集及處理：實驗組接種完成后1、3、5、7天分批心臟采血處死大鼠，正常對照組和免疫抑制對照組于第7天處死，收集大鼠的血清和肺泡灌洗液標本，-20℃下保存?zhèn)溆?。無菌操作下，手術(shù)

8、切取動物的肺、肝、脾等臟器，切取部分臟器組織制成勻漿，接種于沙氏平板上培養(yǎng)。其余內(nèi)臟組織塊放入10％福爾馬林中固定8小時以上，石蠟包埋，并進行蘇木素-伊紅（HE）以及六胺銀（PASM）染色。 4．動物模型標本斑點雜交的檢測： 血清、肺泡灌洗液標本中真菌DNA的提取方法參照文獻進行，將提取好的標本DNA固定于帶正電荷的尼龍膜上，與標記好的煙曲霉長鏈核苷酸探針進行斑點雜交，實驗組與對照組進行對比，斑點雜交法與BALF培養(yǎng)法進

9、行比較。 5．臨床標本的收集及檢測; 臨床病例資料：臨床曲霉菌感染高?；颊?2例，男8例，女4例，其中病理確診2例，臨床診斷4例，擬診6例。收集上述患者的血清或肺泡灌洗液標本，低溫凍存?zhèn)溆谩Ｓ冒唿c雜交技術(shù)進行檢測。 6．統(tǒng)計分析方法：使用SPSS13．0統(tǒng)計軟件，PearsonX2檢驗，多樣本率的比較。 實驗結(jié)果: 1．煙曲霉堿性蛋白酶（ALP）特異性引物PCR擴增結(jié)果： 用合成的煙曲霉特

10、異的引物依次擴增煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、黑曲霉、白念珠菌、銅綠假單孢菌、人全血細胞DNA，擴增產(chǎn)物電泳，結(jié)果顯示除煙曲霉擴增出1條465bp的特異條帶外，其余真菌、細菌均未見特異性擴增帶。結(jié)果表明該對引物對煙曲霉具有高度特異性。產(chǎn)物測序結(jié)果與基因文庫登錄號NC．007197．11為參照序列進行對比，相似度達99％。 2．斑點雜交結(jié)果： 雜交結(jié)果的特異性：提取的煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、乙

11、肝病毒、人全血細胞DNA配制成10mg/ml，各取3μl分別點樣于尼龍膜上，與地高辛標記的煙曲霉特異性探針進行雜交。此探針只與煙曲霉DNA雜交，與其它真菌、細菌DNA無交叉反應(yīng)，結(jié)果表明此探針具有高度的特異性， 雜交結(jié)果的敏感性：將提取的煙曲霉DNA倍比稀釋分別點樣于尼龍膜上，與煙曲霉探針雜交，最低可檢出DNA的量為100fg，結(jié)果表明此探針有高度的敏感性。 3．侵襲性感染模型的建立： 臟器組織培養(yǎng)及血培養(yǎng)：實驗

12、組大鼠尸檢見肝臟腫脹，表面見多個針尖大小的膿點，肺組織表面可見多個大小不等隆起的小結(jié)節(jié)，余內(nèi)臟未見膿點及結(jié)節(jié)。臟器組織培養(yǎng)可見煙綠色菌落生長，質(zhì)地呈絨毛狀，背面呈淡黃色，鏡下觀察見有曲霉孢子和菌絲，菌絲呈條狀有分隔分支呈45°銳角證實為煙曲霉。正常對照組和免疫抑制對照組：臟器培養(yǎng)均未見煙曲霉菌生長。血培養(yǎng)均未見真菌生長。 臟器組織HE染色及PASM染色：實驗組組織病理切片作HE染色，肺和肝組織可見組織內(nèi)炎性細胞浸潤，組織壞死，切

13、片作六胺銀（PASM）染色在壞死組織中可見成堆的菌絲，菌絲呈條狀有分隔，分支為銳角。真菌組織學(xué)培養(yǎng)和組織病理切片六胺銀染色證實為煙曲霉，侵襲性曲霉菌動物模型制作成功。正常對照組和免疫抑制對照組：臟器組織HE染色及PASM染色未見異常 4．動物模型標本檢測結(jié)果： 將收集的血及肺泡灌洗標本提取DNA進行斑點雜交，實驗組陽性率較正常對照組和免疫對照組高，P<0．05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；隨感染時間延長，陽性率逐漸上升，感染后第1

14、天實驗組雜交結(jié)果與免疫抑制和正常對照組差異均無顯著性差異（P>0．00625），感染后第3天血清標本與免疫抑制對照組也無顯著性差異（P>0．00625）。其余各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．00625）?？偟撵`敏度為67．6％，特異度為89．6％。1周內(nèi)肺泡灌洗液斑點雜交法的總陽性率（68．8％）較培養(yǎng)陽性率（31．2％）高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．05），特異度比較斑點雜交法（91．7％）低于肺泡灌洗液培養(yǎng)法（95．8％），但差異無

15、統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．05）。血培養(yǎng)陽性率很低，但所需時間長不利于早期診斷。 5．臨床標本檢測結(jié)果： 在臨床侵襲性曲霉菌感染高?；颊?2例中，經(jīng)病理確診曲霉菌感染2例，臨床診斷曲霉菌感染4例，擬診曲霉菌感染病例6例。將采集的血清和肺泡灌洗液標本提取DNA，用前兩部分建立的斑點雜交法進行檢測，檢測結(jié)果有6例陽性。確診曲霉菌感染病2例斑點雜交檢測均為陽性。臨床診斷的4例中有3例為陽性，6例擬診病例有1例為陽性。其余病例標本經(jīng)斑

16、點雜交檢測，結(jié)果均為陰性。 研究結(jié)論: 1．成功建立了斑點雜交法檢測曲霉菌感染技術(shù)：設(shè)計的煙曲霉種特異性探針對煙曲霉有高度的特異性，與其它真菌、細菌無交叉反應(yīng)，此方法可以將曲霉菌鑒定到種的水平。且靈敏度高，最低可檢測到100fg的真菌DNA． 2．完成了斑點雜交法在侵襲性動物模型中臨床效能的評價：成功建立經(jīng)鼻孔滴入煙曲霉孢子建立動物感染模型，尸檢臟器損害以肺、肝比較明顯。斑點雜交法可以檢測出模型動物血清及肺泡灌洗