免疫蛋白質(zhì)組學(xué)法鑒定煙曲霉免疫優(yōu)勢(shì)抗原及其在侵襲性曲霉病早期診斷中的應(yīng)用.pdf

1、近年來，侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)已成為中性粒細(xì)胞缺乏癥患者重要的死亡原因之一，而且在非中性粒細(xì)胞缺乏癥患者如ICU危重患者甚至免疫功能正常的患者，IA的發(fā)病率亦逐年上升。由于缺乏特異性臨床癥狀和體征，傳統(tǒng)的診斷方法如組織病理學(xué)檢查和真菌培養(yǎng)在感染早期階段缺乏敏感性，因此IA的診斷仍困難，常常到疾病晚期才能診斷或死亡后由尸解獲得。目前診斷IA最有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)曲霉細(xì)胞壁半乳甘露聚糖(galact

2、omannan，GM)的GM實(shí)驗(yàn)。然而，GM實(shí)驗(yàn)的敏感性和特異性尚不能滿足臨床需求。因此，迫切需要研究發(fā)現(xiàn)在感染患者血液或其他體液中出現(xiàn)的真菌抗原，以篩選更敏感、更準(zhǔn)確的疾病標(biāo)志物用于IA的早期診斷。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)確診IA患者血清中常存在高滴度抗曲霉抗體，這一發(fā)現(xiàn)促使我們進(jìn)一步深入研究能用于診斷IA的新的診斷標(biāo)志物。
　　 目的：應(yīng)用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選鑒定煙曲霉免疫優(yōu)勢(shì)抗原；應(yīng)用分子克隆和原核表達(dá)技術(shù)，獲得煙曲霉新的

3、免疫優(yōu)勢(shì)抗原硫氧還蛋白還原酶GliT(TR)的全長(zhǎng)重組蛋白；以重組煙曲霉硫氧還蛋白還原酶GliT抗原為包被抗原，建立測(cè)定人血清中抗煙曲霉硫氧還蛋白還原酶GliT抗體的ELISA法；用IA家兔模型，考察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生特異性anti-TR抗體應(yīng)答的情況；通過檢測(cè)臨床血樣本評(píng)估該法在侵襲性曲霉病診治中的應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法：TCA/丙酮沉淀法制備煙曲霉分泌蛋白及菌體蛋白質(zhì)，用確診IA患者血清與煙曲霉分泌蛋白及菌體蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡，篩

4、選免疫反應(yīng)最強(qiáng)的蛋白質(zhì)。篩選出的免疫反應(yīng)最強(qiáng)的煙曲霉分泌蛋白質(zhì)進(jìn)一步用二維電泳來分離，并用混合確診患者血清進(jìn)行免疫印跡。從2-DE膠上切下有免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切以及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析獲得肽質(zhì)量指紋圖譜，然后利用Mascot查詢軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。對(duì)免疫反應(yīng)最強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)抗原煙曲霉TR進(jìn)行生物信息學(xué)分析。用SignalP軟件預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)是否有信號(hào)肽，用WoLF PSORT預(yù)

5、測(cè)其亞細(xì)胞定位，并用BLAS工程序進(jìn)行同源性分析。用RT-PCR，從煙曲霉總RNA中擴(kuò)增出TR cDNA片段，克隆至pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化E.coli JM109。經(jīng)序列分析證實(shí)后，提取重組克隆質(zhì)粒雙酶切獲得目的基因，與表達(dá)載體pET28a(+)連接，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，篩選重組表達(dá)質(zhì)粒。用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組融合蛋白表達(dá)，用SDS-PAGE及免疫印跡法分析重組蛋白，親和層析柱純化重組蛋

6、白。
　　 新西蘭白兔注射可的松造模，靜脈注射煙曲霉分生孢子，建立IA動(dòng)物模型。以重組煙曲霉TR為包被抗原，建立檢測(cè)anti-TR抗體的間接ELISA法，并觀察IA家兔模型血清中anti-TR抗體產(chǎn)生的情況。收集經(jīng)組織病理學(xué)檢查和/或真菌培養(yǎng)證實(shí)的各類IA患者血清，以健康體檢者、無IA但血培養(yǎng)為其他真菌及細(xì)菌的患者血清為對(duì)照，用ELISA法測(cè)定血清中的anti-TR水平，確定cut off值并對(duì)方法的敏感性和特異性進(jìn)行考察。

7、r>　　 結(jié)果：
　　 (1)煙曲霉分泌蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性在反應(yīng)強(qiáng)度及反應(yīng)數(shù)量上均優(yōu)于菌體蛋白質(zhì)。在4種不同培養(yǎng)基的分泌蛋白質(zhì)中，用YEPG培養(yǎng)煙曲霉14 d的分泌蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性最強(qiáng)，有免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶數(shù)量最多，擬用于免疫蛋白質(zhì)組學(xué)分析，進(jìn)一步篩選特異性煙曲霉抗原。
　　 (2)煙曲霉分泌蛋白質(zhì)的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，確診IA患者血清與分泌蛋白質(zhì)中多種抗原反應(yīng)強(qiáng)烈。40個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被抗體陽性IA患者血清識(shí)別

8、。對(duì)40個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)質(zhì)譜分析，成功鑒定了39個(gè)免疫反應(yīng)陽性的蛋白質(zhì)點(diǎn)，代表17種蛋白質(zhì)。多數(shù)鑒定蛋白質(zhì)為參與碳水化合物、脂肪酸、氨基酸和能量代謝的代謝酶。在鑒定出的17種蛋白質(zhì)中，已知有7種蛋白質(zhì)為曲霉或其他真菌抗原，有10種為新發(fā)現(xiàn)的有免疫原性的蛋白質(zhì)，如延胡索酰乙酰乙酸水解酶FahA、醛脫氫酶AldA、芳香基氨基轉(zhuǎn)移酶Aro8、G-蛋白復(fù)合物β亞基CpcB、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架蛋白(VIP1)、phytanoyl-CoA二氧化酶家族、尿酸

9、氧化酶UaZ、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶、蛋白酶體組分Pre8和假想蛋白。有7種免疫原性蛋白顯示有多個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。令我們感興趣的一個(gè)免疫反應(yīng)最強(qiáng)的蛋白質(zhì)，鑒定為硫氧還蛋白還原酶GlibT(TR)。
　　 (3)用SignalP軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示TR帶有信號(hào)肽(signalP probability，0.808)；WoLFPSORT軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示TR為胞外蛋白質(zhì)(Query Protein WoLFPSORT prediction：ex

10、tr，12.0；cyto，6.5；cyto_nucl，4.0；mito，3.0；pero，2.0)；用BLAS工程序進(jìn)行同源性分析顯示，TR與人源蛋白質(zhì)沒有同源性，且與其他真菌同源性低，如與白念珠菌蛋白質(zhì)的同源性為25％，熱帶念珠菌25％，光滑念珠菌24％，季也蒙念珠菌27％，釀酒酵母菌24％，馬爾尼菲青霉27％。因此，是一個(gè)理想的診斷標(biāo)志物。
　　 (4)成功構(gòu)建了含煙曲霉TR全長(zhǎng)基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，重組質(zhì)粒中目的片段測(cè)序結(jié)果

11、顯示與GenBank公布的煙曲霉TR全長(zhǎng)基因的編碼序列完全一致。重組表達(dá)工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，超聲破碎后裂解上清經(jīng)SDS-PAGE在分子質(zhì)量(Mr)約36000處出現(xiàn)目的蛋白質(zhì)條帶，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為煙曲霉TR，序列覆蓋度37％。多數(shù)重組蛋白質(zhì)為可溶性蛋白；經(jīng)Talon金屬親和層析柱純化后，SDS-PAGE見單一重組蛋白質(zhì)條帶，純度達(dá)91.1％。純化后的TR蛋白經(jīng)電泳分離后，分別與抗His標(biāo)簽單抗、確診IA患者血清及健康人混合血清進(jìn)行免疫印跡

12、。結(jié)果顯示：重組蛋白帶有His標(biāo)簽并具有免疫反應(yīng)性，可與IA患者血清特異性結(jié)合，而與健康人混合血清無反應(yīng)。
　　 (5)用家兔IA模型評(píng)估對(duì)煙曲霉TR的抗體應(yīng)答情況，結(jié)果顯示家兔在煙曲霉感染后7天即出現(xiàn)anti-TR抗體，且抗體滴度快速上升。提示anti-TR抗體在IA早期階段即產(chǎn)生，可以作為診斷IA的可靠標(biāo)志物。
　　 (6)以重組TR抗原為包被抗原建立的檢測(cè)anti-TR抗體ELISA法精密度良好，批內(nèi)CV％=8.5

13、7％，批間CV％=12.17％。anti-TR抗體檢測(cè)診斷非粒缺患者IA的敏感性和特異性達(dá)80.9％和96％，明顯優(yōu)于GM實(shí)驗(yàn)(p＜0.01)。35.9％(15/42)非粒缺IA患者anti-TR陽性而GM始終陰性。在入院首次血樣檢測(cè)中，69％(29/42)非粒缺IA患者anti-TR抗體陽性。聯(lián)合檢測(cè)anti-TR和GM，可使敏感性提高至88.1％。
　　 結(jié)論：我們用免疫蛋白組學(xué)方法鑒定了IA疾病過程中表達(dá)的17種抗原，其中