環(huán)孢素A和IFN-alpha治療Vogt-小柳原田綜合征和Behcet病的機(jī)制研究.pdf

1、Vogt—小柳原田(VKH)綜合征和Behcet病是我國(guó)最為常見和致盲率最高的兩種葡萄膜炎類型。目前一般認(rèn)為它們是由自身免疫反應(yīng)所介導(dǎo)的疾病。以往認(rèn)為Th1細(xì)胞是導(dǎo)致葡萄膜炎發(fā)生的效應(yīng)細(xì)胞，近年的研究發(fā)現(xiàn)，IL—23/IL-17(IL-17主要為Th17細(xì)胞分泌)在VKH綜合征發(fā)病中起著重要作用(Chiw，YangP，LiB，etal.JAllergyclinimmunol，2007，119，1218-1224.)。究竟是Th1細(xì)胞在葡

2、萄膜炎的發(fā)生中起作用，還是Th17細(xì)胞，或者是二者同時(shí)起作用，目前尚不清楚。 臨床上一般用激素和免疫抑制劑對(duì)這兩種葡萄膜炎進(jìn)行治療，取得很好的臨床效果。近年來，生物制劑在葡萄膜炎中的治療作用受到廣泛關(guān)注，并且取得較好的臨床效果。但有關(guān)這些藥物作用的確切機(jī)制目前尚不清楚。 本論文正是基于上述背景，進(jìn)行了以下三個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)：(1)探討Th1和Th17細(xì)胞在VKH綜合征發(fā)病中的作用；(2)探討常用的免疫抑制劑是否通過抑制Th1

3、、Th17細(xì)胞來發(fā)揮作用。(3)探討生物制劑能否抑制IL-17的產(chǎn)生，以及其可能的機(jī)制。通過上述研究，以期對(duì)葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制有更深入的認(rèn)識(shí)，為其防治研究尋找新的靶點(diǎn)。同時(shí)通過對(duì)常用藥物作用機(jī)制的研究，以期為臨床治療提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。 第一部分Th1和Th17細(xì)胞在Vogt—小柳原田綜合征發(fā)病中的作用 1、目的:研究Th1和Th17細(xì)胞在VKH綜合征發(fā)病中的作用。 2、方法: 2.1分別抽取活動(dòng)期未用藥

4、的和用藥后靜止期的VKH綜合征患者(各8人)和正常人(8人)外周靜脈血，分離這些患者和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。 2.2采用ELISA方法檢測(cè)上述這些患者和正常人PBMC培養(yǎng)上清中IL-17和IFN—γ的水平。 2.3應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)用藥前后，分別處于活動(dòng)期和靜止期的VKH綜合征患者以及正常人外周血中Th1、Th17細(xì)胞的比例。 2.4抽提細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用PCR技術(shù)檢測(cè)上述患者和正常人PBMC

5、中Th1和Th17細(xì)胞因子及其轉(zhuǎn)錄因子T—bet和RORgammat的水平。 3、結(jié)果: 3.1VKH綜合征患者和正常人PBMC中Th17細(xì)胞的比例。活動(dòng)期VKH綜合征患者外周血中CD4+IFN—γ+細(xì)胞(Th1細(xì)胞)和CD4+IL-17+細(xì)胞(Th17細(xì)胞)比例顯著高于靜止期患者和正常人；VKH綜合征患者外周血中同時(shí)還存在CD8+IL-17+細(xì)胞和CD4+IFN—γ+IL-17+細(xì)胞，而且這兩群細(xì)胞的比例在活動(dòng)期葡萄膜

6、炎患者中明顯高于靜止期患者和正常人。 3.2VKH綜合征患者和正常人PBMC中IL-17的水平。結(jié)果顯示：活動(dòng)期VKH綜合征患者PBMC培養(yǎng)上清中IL-17的水平顯著高于靜止期患者和正常人。 3.3VKH綜合征患者和正常人PBMC中IFN—γ的水平。結(jié)果顯示：活動(dòng)期VKH綜合征患者PBMC培養(yǎng)上清中IFN—γ的水平顯著高于靜止期患者和正常人。 3.4VKH綜合征患者和正常人PBMC中細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的水平。結(jié)果顯示：

7、活動(dòng)期VKH綜合征患者PBMC中IL-17，IFN—γ，T—bet和RORgammat的水平顯著高于靜止期患者和正常人。 4、結(jié)論: 我們的研究證實(shí)，這兩群細(xì)胞的比例，細(xì)胞因子的分泌及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)均與葡萄膜炎的活動(dòng)性相關(guān)。提示Th1和Th17細(xì)胞參與了VKH綜合征的發(fā)病。 第二部分環(huán)孢素A和激素治療VKH綜合征的作用機(jī)制研究 1、目的:研究環(huán)孢素和激素是否通過抑制Th1、Th17或兩者來發(fā)揮其治療V

8、KH綜合征的作用。 2、方法: 2.1抽取8例近兩個(gè)月未用過任何免疫抑制劑的活動(dòng)期VKH患者的外周血。然后給予這些患者環(huán)孢素A(3.0-5.0mg/kg/day)和口服激素(15-20mg/d)治療，三個(gè)月后再次采集其外周血。正常人作為對(duì)照。 2.2分離上述患者的PBMC，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)環(huán)孢素治療前后患者外周血中Th1、Th17細(xì)胞的比例。 2.3分離上述患者的PBMC，體外培養(yǎng)，用ELISA檢測(cè)治療前

9、后患者PBMC培養(yǎng)上清中IL-17和IFN—γ的水平。 2.4體外用不同濃度的環(huán)孢素和激素刺激活動(dòng)期未用藥患者的PBMC，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)環(huán)孢素和激素在體外對(duì)Th1、Th17細(xì)胞比例的影響。 2.5體外用不同濃度的環(huán)孢素和激素刺激活動(dòng)期未用藥患者的PBMC，用ELISA評(píng)價(jià)環(huán)孢素和激素在體外對(duì)IL-17、IFN—γ的產(chǎn)生的影響。 3、結(jié)果: 3.1用環(huán)孢素和激素治療以后患者外周血中Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞

10、比例較用藥前顯著下降，達(dá)到和正常人相當(dāng)?shù)乃健?3.2用環(huán)孢素和激素治療以后的患者PBMC分泌IL-17和IFN—γ的水平較用藥前顯著下降。 3.3環(huán)孢素和地塞米松在體外可以下調(diào)活動(dòng)期VKH綜合征患者Th1、Th17細(xì)胞的比例。 3.4環(huán)孢素和地塞米松在體外可以顯著抑制活動(dòng)期VKH綜合征患者PBMC分泌IL-17和IFN—γ，且兩種藥物的作用在一定范圍內(nèi)都呈劑量依賴性。聯(lián)合環(huán)孢素和激素可以起到協(xié)同的作用。

11、 4、結(jié)論: 我們的研究證實(shí)，環(huán)保素和激素通過同時(shí)抑制Th1、Th17細(xì)胞來發(fā)揮其治療VKH綜合征的作用。聯(lián)合兩種藥物可以起到協(xié)同作用。 第三部分IFN—α治療Behcet病的作用機(jī)制研究 1、目的:研究IFN—α是否能夠抑制Behcet病患者表達(dá)IL-17，以及具體的作用機(jī)制 2、方法 2.1抽取8例活動(dòng)期未用藥的Behcet病患者和16例正常人外周血，分離PBMC。 2.2體外用重組的

12、IFN—α和活動(dòng)期Behcet患者PBMC共同培養(yǎng)，用ELISA檢測(cè)IFN—α對(duì)IL-17產(chǎn)生的影響。同時(shí)檢測(cè)同一細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10的水平。 2.3體外用重組IFN—α和PBMC共培養(yǎng)，同時(shí)加入IL-10的阻斷抗體，用ELISA評(píng)價(jià)阻斷IL-10是否可以阻斷或部分阻斷IFN—α對(duì)IL-17的抑制作用。 2.4體外用重組IL-10和PBMC共培養(yǎng)，用ELISA進(jìn)一步評(píng)價(jià)IFN—α是否通過IL-10來發(fā)揮其抑制IL-1

13、7的作用。 3、結(jié)果: 3.1IFN—α可以抑制活動(dòng)期Behcet病患者PBMC分泌IL-17，同時(shí)可以誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生。且IFN—α的這種作用，在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。 3.2加入IL-10的阻斷抗體后，IFN—α抑制活動(dòng)期Behcet患者PBMC產(chǎn)生IL-17的作用顯著降低。 3.3體外重組的IL-10可以顯著抑制活動(dòng)期Behcet患者PBMCIL-17的產(chǎn)生。 4、結(jié)論:IFN—α可能