Rho激酶在2型糖尿病中的遺傳及功能研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 Rho激酶在2型糖尿病人群中的遺傳學(xué)研究
　　目的：
　　眾所周知，2型糖尿病是一種環(huán)境因素與遺傳因素相互作用所致、多種致病因素參與的慢性復(fù)雜疾病。迄今研究發(fā)現(xiàn)其主要的病理生理機(jī)制是外周組織胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)和胰島?細(xì)胞分泌功能衰竭，但相同環(huán)境下不同個(gè)體對(duì)2型糖尿病發(fā)病表現(xiàn)出易感性差異的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。盡管目前對(duì)于糖尿病易感

2、基因的探尋已取得不菲的成績(jī)，但研究人員發(fā)現(xiàn)已被證實(shí)的糖尿病基因易感位點(diǎn)僅能解釋極小部分糖尿病人的發(fā)病原因。新的糖尿病遺傳易感位點(diǎn)的尋找及鑒定將會(huì)促進(jìn)對(duì)糖尿病新的病理生理機(jī)制研究，從而為發(fā)展新的糖尿病治療靶點(diǎn)和治療策略提供契機(jī)。
　　既往大量研究證實(shí)胰島素受體底物1（IRS-1）絲氨酸磷酸化在胰島素抵抗過程中起著至關(guān)重要的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)Rho相關(guān)卷曲蛋白激酶（ROCK）可以通過影響IRS-1絲氨酸磷酸化的水平來調(diào)節(jié)機(jī)體胰島素信號(hào)

3、途徑及糖代謝平衡。并且體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Rho/ROCK信號(hào)通路不僅可以調(diào)控胰島?細(xì)胞功能而且顯著上調(diào)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄。因此Rho/ROCK信號(hào)通路可能參與胰島素抵抗、糖代謝紊亂以及2型糖尿病等疾病的病理生理機(jī)制。
　　在本研究中，首先在2型糖尿病病例外周血白細(xì)胞DNA樣本中對(duì)ROCK基因潛在功能區(qū)進(jìn)行測(cè)序。針對(duì)所發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)同時(shí)在2型糖尿病病例對(duì)照人群中進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析以及構(gòu)建包含相關(guān)DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)行功能分析，分別從表型及

4、分子機(jī)制兩方面進(jìn)一步明確ROCK是否能從遺傳學(xué)角度影響2型糖尿病的易感性。
　　實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果：
　　利用雙脫氧終止法原理采用ABI自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)48例2型糖尿病的ROCK基因外顯子區(qū)域進(jìn)行再測(cè)序，總共發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism）（SNP）位點(diǎn)8個(gè)。其中僅3個(gè)SNP位點(diǎn)的最小等位基因頻率超過5％，分別是位于10號(hào)外顯子導(dǎo)致第431位氨基酸蘇氨酸改變?yōu)樘於０返膔s22307

5、74（C/A），以及位于mRNA3′端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）的rs978906（A/G）和rs71932930（-/CAAAAA）。由于連鎖分析發(fā)現(xiàn)位于3′UTR上的兩個(gè)SNP位點(diǎn) rs978906和rs71932930處于緊密連鎖關(guān)系。因此在所收集的1920對(duì)性別年齡相匹配的2型糖尿病病例對(duì)照人群中針對(duì)rs2230774和rs978906這兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型以及遺傳關(guān)聯(lián)分析。然而并未發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SN

6、Ps與糖尿病易感性具有顯著的關(guān)聯(lián)（P>0.05）。為進(jìn)一步探索這兩個(gè)位點(diǎn)與糖代謝相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系，384例行OGTT檢測(cè)的健康對(duì)照人群也進(jìn)行這兩個(gè)位點(diǎn)的遺傳關(guān)聯(lián)分析。同樣，這兩個(gè)位點(diǎn)并沒有影響糖代謝的各相關(guān)指標(biāo)（P>0.05）。最后，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)位于ROCK基因mRNA的3′UTR上的兩個(gè)SNPs是否位于MicroRNAs可能的結(jié)合區(qū)域，同時(shí)將預(yù)測(cè)可能影響MicroRNAs（Has-mir-33a和Has-mir-33b）結(jié)合的

7、包含rs978906不同等位基因（A和G）3′UTR區(qū)分別克隆至pMIR-Report載體，并轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中運(yùn)用雙熒光報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證。熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)包含rs978906不同基因型（野生型和突變型）片段的pMIR-Report質(zhì)粒在加入或者不加入預(yù)測(cè)MicroRNAs情況下，其熒光數(shù)據(jù)均無顯著性差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　在對(duì)ROCK基因外顯子測(cè)序所發(fā)現(xiàn)的SNPs中，均未發(fā)現(xiàn)這些SNPs對(duì)2型糖尿病的易感

8、性具有顯著影響。
　　第二部分 Rho激酶在2型糖尿病中異常激活
　　目的：
　　Rho作為單體GTP酶Ras超家族成員，是目前研究最為清楚的小分子GTP結(jié)合蛋白之一。它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的聚合狀態(tài)從而參與調(diào)控細(xì)胞眾多的生物學(xué)功能包括細(xì)胞收縮、遷移、增殖及凋亡等。G蛋白偶聯(lián)受體被其上游信號(hào)（血管緊張素II，內(nèi)皮素等）耦合后可以激活Rho，Rho轉(zhuǎn)膜后激活Rho蛋白相關(guān)激酶。Rho蛋白相關(guān)激酶是最早發(fā)現(xiàn)的Rho蛋白

9、下游最主要和最直接的效應(yīng)物。Rho激酶活化后的下游主要靶分子為肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）上面的肌動(dòng)蛋白結(jié)合亞基（MBS）。這條信號(hào)通路異常活化后主要在改變內(nèi)皮通透性及內(nèi)皮功能障礙相關(guān)心血管疾病的病理生理機(jī)制中起著重要的調(diào)控作用。目前對(duì)于Rho/Rho激酶信號(hào)通路的研究主要集中在心血管系統(tǒng)疾病如高血壓、高血脂、冠心病、肺動(dòng)脈高壓、心衰、心肌肥厚以及中風(fēng)等。大量研究數(shù)據(jù)顯示在各種心血管系統(tǒng)疾病中均可觀察到Rho激酶信號(hào)通路的異常激活，說

10、明該信號(hào)通路的活化密切參與這些疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程。因此，Rho/Rho激酶信號(hào)通路正成為心血管系統(tǒng)疾病新治療靶點(diǎn)的研究熱點(diǎn)。
　　近年來，Rho/Rho激酶信號(hào)通路在胰島素抵抗以及糖尿病中的作用日益受到研究人員的重視。越來越多的研究數(shù)據(jù)表明Rho激酶可以通過直接介導(dǎo)胰島素信號(hào)途徑中的胰島素受體底物1（IRS-1）參與糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制。大量糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)均可以發(fā)現(xiàn)Rho/Rho激酶信號(hào)通路的異常激活。然而，

11、在臨床上2型糖尿病患者體內(nèi)是否存在Rho/Rho激酶信號(hào)通路的異常激活并不清楚。從臨床角度闡明這一重要問題對(duì)于進(jìn)一步明確2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制以及研究新的治療靶點(diǎn)意義重大。因此，本研究擬從臨床角度研究2型糖尿病患者體內(nèi)Rho激酶活性變化以及Rho激酶活化水平與糖代謝相關(guān)性狀之間的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果：
　　本研究共計(jì)收集2型糖尿病病例41例（男性占56.1％，平均年齡為51.3±6.0歲）以及正常對(duì)照37例（男性占51.

12、4％，平均年齡為50.4±4.1歲），并抽取研究對(duì)象外周空腹靜脈血。其中，7例2型糖尿病患者完成中位數(shù)為8周的隨訪。詳細(xì)記錄所有納入研究的研究對(duì)象的各項(xiàng)臨床相關(guān)資料。白細(xì)胞中Rho激酶活性水平使用蛋白免疫印跡雜交的方法進(jìn)行測(cè)定。最后使用灰度分析，計(jì)算肌球蛋白輕鏈磷酸酶中的磷酸化肌球蛋白結(jié)合亞基（pMBS）表達(dá)水平以及總肌球蛋白結(jié)合亞基（tMBS）表達(dá)水平之間的比值即為Rho激酶的活性大小。所有研究對(duì)象的總肌球蛋白結(jié)合亞基表達(dá)水平使用內(nèi)參

13、進(jìn)行統(tǒng)一校正。研究結(jié)果顯示，2型糖尿病患者體內(nèi)Rho激酶活化水平(pMBS/tMBS：0.80±0.11)顯著高于正常對(duì)照組（pMBS/tMBS：0.71±0.08,P=0.01)。同時(shí)，所有研究對(duì)象中的糖化血紅蛋白濃度與 Rho激酶活化水平之間存在著直線相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。其他臨床相關(guān)性狀如年齡、體重指數(shù)、空腹血糖、收縮壓、舒張壓等均與Rho激酶活化水平?jīng)]有直線相關(guān)關(guān)系（所有P值均>0.05）。行亞組分析后，發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病組中

14、糖化血紅蛋白濃度與Rho激酶活化水平之間存在著顯著的直線相關(guān)關(guān)系（R=0.52,P=0.01）。而在正常對(duì)照組中所有的臨床相關(guān)性狀包括糖化血紅蛋白濃度均與Rho激酶活化水平之間沒有顯著直線相關(guān)關(guān)系（所有P值均>0.05）。經(jīng)過中位數(shù)時(shí)間為8周的標(biāo)準(zhǔn)化治療后，所有隨訪2型糖尿病患者的Rho激酶活化水平顯著下降（P=0.04）。
　　結(jié)論：
　　上述研究結(jié)果首次從臨床角度提供證據(jù)證實(shí)2型糖尿病患者體內(nèi)Rho激酶活性顯著高于正常對(duì)