hPP10-SOD融合蛋白表達(dá)及其抗氧化功效研究.pdf

1、　　目的：超氧化物歧化酶是一類清除自由基的蛋白酶,對(duì)需氧生物的生存起著重要的作用,是生物體防御氧自由基毒性的關(guān)鍵分子。研究表明SOD具有抗衰老,免疫調(diào)節(jié),抗輻射以及護(hù)膚美容等功效,它既可作為藥用酶,亦可以作為化妝品,食品添加劑。但是因其分子量大,不能跨膜進(jìn)入細(xì)胞,或透過(guò)致密的皮膚角質(zhì)層,口服或皮膚涂抹吸收的效率有待提高。而細(xì)胞膜穿透肽(CPP)可以作為一個(gè)新型載體攜帶SOD進(jìn)入細(xì)胞漿或胞核內(nèi),提高SOD的吸收和抗氧化效率。本課題運(yùn)用了本

2、人所在研究小組自主開發(fā)的人源性細(xì)胞膜穿透肽(hPP10)攜帶人源性Cu·Zn-SOD跨膜進(jìn)入培養(yǎng)細(xì)胞,并觀察了其抗氧化效率。
　　方法：(1)克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒pET15b-SOD,pET15b-hPP10-SOD；(2)獲得原核表達(dá)純化的蛋白SOD及融合蛋白hPP10-SOD,Western blot鑒定正確性；(3)免疫熒光鑒定hPP10-SOD的穿膜效應(yīng),Western blot鑒定穿膜效應(yīng)及時(shí)間梯度和濃度梯度效應(yīng)(4)SO

3、D酶活檢測(cè)試劑盒檢測(cè)hPP10-SOD穿膜后的SOD酶活性檢測(cè)(5)MTT法檢測(cè)hPP10對(duì)細(xì)胞活性的影響。
　　結(jié)果：(1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET15b-SOD,pET15b-hPP10-SOD；(2)獲得純化蛋白SOD及融合蛋白hPP10-SOD,通過(guò)Western blot鑒定條帶都是正確的；(3)免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明5μM濃度的hPP10-SOD轉(zhuǎn)導(dǎo)Hela細(xì)胞具有明顯的穿膜效應(yīng), Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果表明

4、hPP10-SOD轉(zhuǎn)導(dǎo)Hela,Caski細(xì)胞具有濃度依賴性,細(xì)胞內(nèi)hPP10-SOD濃度可持續(xù)24h；(4)10μM的hPP10-SOD轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞具有很好的抗氧化活性(p<0.05)；(5)40μM濃度的hPP10-SOD對(duì)于細(xì)胞活力的影響甚小。
　　結(jié)論：hPP10作為新型的人原性細(xì)胞膜穿透肽具有很好的穿膜效率；通過(guò)免疫熒光,westeren blot鑒定,SOD活性檢測(cè)分析驗(yàn)證了融合蛋白hPP10-SOD具有明顯的穿膜效應(yīng)和