蛋白多糖在腦組織細胞缺血缺氧炎性反應信號轉導的作用及其調控機理的實驗研究.pdf

1、目的：觀察蛋白多糖在人臍靜脈血管內皮細胞、腦皮質微血管內皮細胞、神經(jīng)膠質細胞缺氧復氧損害和大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷的炎性反應中的作用及其調控機理，為缺血性腦血管疾病的抗炎治療尋找新的靶點。 方法： 1．建立人臍靜脈血管內皮細胞體外培養(yǎng)，給予HEEL、GAG、heparinase、Sdc—lab、Sdc-3Ab、CAP37Ab預培養(yǎng)6h，然后再予以常氧環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)和缺氧2h／復氧2h處理。 2．建立大鼠腦皮質微

2、血管內皮細胞體外培養(yǎng)，給予HEEL、GAG、heparinase、Sdc一1Ab、Sdc-3Ab、CAP37Ab預培養(yǎng)6h，然后再予以常氧環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)和缺氧2h／復氧2h處理。 3．建立大鼠星型神經(jīng)膠質細胞體外培養(yǎng)，給予HEEL、GAG、heparinase、Sdc—lAb、Sdc-3Ab、CAP37Ab預培養(yǎng)6h，然后再予以常氧環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)和缺氧2h／復氧2h處理。 以上各組又分為正常對照組(即不處理)和各不同干預組。

3、 4．建立大鼠大腦中動脈阻塞腦缺血模型(MCAO)，隨機分為假手術組和缺血2h／再灌注4、24、72h和7d組，造模成功后分別進行生理鹽水、HEEL和GAG尾靜脈注射處理。 5．人臍靜脈血管內皮細胞細胞活力(MTT法)檢測。 6．應用免疫組織化學檢測粘結合蛋白多糖一1(syndecan．1)、粘結合蛋白多糖一3(syndecan-3)、細胞外信號調節(jié)酶(ERK2)和肝磷脂結合蛋白(azurocidin,CAP37

4、)的表達。 7．應用原位雜交檢測ERK2mRNA；應用ELISA檢測單核細胞一巨噬細胞刺激克隆因子。 8．應用RT-PCR檢測syndecan一1mRNA和CAP37mRNA的表達；應用westernblot檢測syndecan一1和CAP37蛋白質的表達。 9．測定大鼠局灶性缺血／再灌注各干預組在相應的時間點(4h、24h、72h、7d)神經(jīng)功能缺失體征和病理改變。 結果： 1．常氧條件下，人臍

5、靜脈血管內皮細胞對照組和各干預組細胞活力表達基本正常，無顯著差異；缺氧／復氧處理后，對照組細胞活力明顯下降，各干預組細胞活力明顯上調，組間無明顯差異。 2．人臍靜脈血管內皮細胞在常氧條件下培養(yǎng)，syndecan-1有陽性表達，缺氧復氧后表達明顯上調；常氧條件培養(yǎng)，HEEL、GAG、heparinase、Sdc一1Ab、Sdc-3Ab和CAP37Ab組均能明顯上調syndecan．1；缺氧復氧培養(yǎng)，HEEL、GAG、heparin

6、ase、Sdc—lab、Sdc-3Ab和CAP37Ab組能明顯上調syndecan一1，其中heparinase、Sdc一1Ab、Sdc-3Ab和CAP37Ab上調作用更明顯。 3．人臍靜脈血管內細胞常氧條件下培養(yǎng)，對照組CAP37有陽性表達，缺氧復氧對照組CAP37表達有輕微上調；常氧條件培養(yǎng)，HEEL和CAP37Ab能輕微上調CAP37的表達，heparinase能輕度下調，余組與對照組表達相似；缺氧復氧處理后，各干預組與常

7、氧組相比，都能上調CAP37表達，其中HEEL和CAP37Ab更明顯。 4．人臍靜脈血管內皮細胞常氧條件下，對照組和各干預組syndecan-3有輕微弱陽性表達；缺氧／復氧處理后，heparinase、Sdc—lab、Sdc-3Ab和CAP37Ab能輕度上調syndecan-3，而HEEL和GAG作用不明顯。 5．人臍靜脈血管內皮細胞常氧下，對照組ERK2表達陽性，缺氧／復氧對照組ERK2有輕度上調；常氧條件培養(yǎng)，各干預

8、組都有陽性表達，其中heparinase和CAP37Ab有輕度上調；缺氧復氧處理，各干預組都能明顯上調ERK2表達，但GAG、heparinase和CAP37Ab作用更明顯。 6．人臍靜脈血管內皮細胞常氧培養(yǎng)上清液對照組GM-CSF表達正常，缺氧復氧對照組GM-CSF明顯上調；常氧培養(yǎng)HEEL、GAG、heparinase和CAP37Ab組GM-CSF與常氧對照組相比表達明顯下調，而Sdc．1Ab和Sdc-3Ab不明顯；缺氧復氧

9、處理HEEL、GAG、heparinase和CAP37Ab組與缺氧對照組相比GM-CSF表達明顯下調，而Sdc一1Ab和Sdc-3Ab不明顯。 7．大鼠腦皮質微血管內皮細胞常氧條件，對照組syndecan一1有陽性表達，缺氧復氧對照組有輕度上調；常氧培養(yǎng)各干預組能輕度上調syndecan一1；缺氧復氧處理后，各組都能上調syndecan—l表達，其中GAG、Sdc一1Ab、Sdc-3Ab和CAP37Ab上調作用更明顯。

10、8．大鼠腦皮質微血管內皮細胞常氧培養(yǎng)對照組CAP37有陽性表達，缺氧復氧對照組有明顯上調；常氧條件培養(yǎng)各干預組都能上調CAP37表達，缺氧復氧處理各干預組與常氧條件下各組相比能明顯上調CAP37表達。 9．大鼠腦皮質微血管內皮細胞常氧培養(yǎng)對照、HEEL、GAG和heparinase組syndecan-3表達弱，而Sdc一1Ab、Sdc-3Ab和CAP37表達有輕微陽性；缺氧／復氧處理后對照組和干預組均能上調syndecan-3表

11、達，但HEEL、GAG和CAP37Ab作用更明顯。 1O．大鼠腦皮質微血管內皮細胞常氧培養(yǎng)對照組和干預組都有ERK2陽性表達，缺氧復氧處理后對照組和干預組都能上調ERK2的陽性表達，其中HEEL、GAG和heparinase上調作用更明顯。 11．大鼠腦皮質微血管內皮細胞常氧培養(yǎng)上清液對照組GM-CSF表達正常，缺氧復氧對照組GM-CSF明顯上調；常氧培養(yǎng)HEEL、GAG、heparinase和CAP37Ab組GM-CS

12、F與常氧對照組相比表達明顯下調，而Sdc一1Ab和Sdc-3Ab不明顯；缺氧復氧處理HEEL、GAG、heparinase和CAP37Ab組與缺氧對照組相比GM-CSF表達明顯下調，而Sdc．1Ab和Sdc-3Ab不明顯。 12．大鼠腦星型膠質細胞常氧培養(yǎng)對照組和各干預組syndecan一1陽性表達不明顯；缺氧復氧處理后對照組和干預組syndecan-1陽性表達也不明顯。 13．大鼠腦星型膠質細胞常氧培養(yǎng)對照組CAP37

13、有陽性表達，缺氧／復氧處理對照組CAP37表達有上調；常氧條件下培養(yǎng)，各干預組均能上調CAP37，但GAG和heparinase作用更明顯；缺氧／復氧處理后，各干預組與常氧各組和缺氧復氧對照組相比均能上調CAP37表達，但HEEL、GAG和heparinase組更明顯。 14．大鼠腦星型膠質細胞常氧培養(yǎng)對照組和各干預組syndecan-3陽性表達不明顯；缺氧復氧處理后對照組和干預組syndecan-3陽性表達也不明顯。

14、15．大鼠腦星型膠質細胞常氧培養(yǎng)對照組和干預組ERK2有陽性表達，缺氧復氧處理后對照組和干預組ERK2陽性表達有上調，其中HEEL和GAG組作用更明顯。 16．大鼠腦星型膠質細胞常氧培養(yǎng)上清液對照組GM-CSF表達正常，缺氧培養(yǎng)對照組GM-CSF表達增加；常氧條件培養(yǎng)HEEL、GAG和heparinase組能明顯降低GM-CSF表達，而其余各組與對照組表達相同；缺氧復氧處理后，與缺氧對照組相比HEEL、GAG和heparinas

15、e組能明顯下調GM-CSE而其余各干預組GM-CSF上調明顯。 17．大鼠MCAO后，HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明顯改善神經(jīng)功能缺失體征評分，HEEL和GAG組間無差異。 18．大鼠MCAO后，HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明顯減少局灶性腦缺血／再灌注損傷病灶炎性細胞浸潤，HEEL和GAG組間無差異。 19．大鼠MCAO后，HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明

16、顯增加局灶性腦缺血／再灌注損傷周圍帶syndecan一1的表達，HEEL和GAG組問無差異。 20．大鼠MCAO后，HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明顯增加局灶性腦缺血／再灌注損傷周圍帶ERK2的表達，并增加ERK2的表達時間，在72h和7d觀察時間點還可見ERK2的表達。HEEL和GAG兩組間作用無差異。 21．大鼠MCAO后，RT-PCR檢測顯示HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明顯增加

17、局灶性腦缺血／再灌注損傷周圍帶syndecan一1mRNA和CAP37mRNA的表達。HEEL和GAG兩組間作用無差異。 22．大鼠MCAO后，ELISA檢測顯示HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明顯減少局灶性腦缺血／再灌注損傷周圍帶GM-CSF的表達。而且HEEL降低GM-CSF比GAG更明顯，兩組間也有明顯差異。 結論：蛋白多糖(syndecan一1、syndecan-3、CAP37)在腦組織細胞的缺血