利用誘導(dǎo)性NR1條件基因敲除小鼠研究NMDA受體在空間記憶提取中的作用.pdf

1、大量研究表明，海馬神經(jīng)元突觸的NMDA受體在空間記憶的信息處理過程中起著重要的分子開關(guān)的作用。長(zhǎng)期空間記憶與其它類型的長(zhǎng)期記憶一樣，可分為獲得、鞏固、儲(chǔ)存及提取四個(gè)階段，探討NMDA受體在空間記憶不同階段的功能，不僅有助于理解空間記憶的形成過程和分子機(jī)制，還將對(duì)闡述記憶的本質(zhì)等問題有重要啟示作用。 藥理學(xué)和遺傳學(xué)的證據(jù)都揭示海馬NMDA受體的活性和NMDA受體依賴的突觸可塑性在動(dòng)物空間記憶的獲得、鞏固和儲(chǔ)存階段起著關(guān)鍵作用，在任

2、務(wù)學(xué)習(xí)之前以及任務(wù)記憶的鞏固和儲(chǔ)存階段阻斷NMDA受體的作用、或敲除NMDA受體的核心亞基NR1基因，都將妨礙動(dòng)物空間記憶的形成。但以往的工作對(duì)NMDA受體在記憶提取過程中的作用還少有涉及。 本文將Cre／loxP重組系統(tǒng)與四環(huán)素操縱子中的人工轉(zhuǎn)錄活化因子tTA結(jié)合起來，即利用誘導(dǎo)性的條件基因敲除技術(shù)（第三代基因敲除技術(shù)），構(gòu)建了在海馬CA1亞區(qū)和前腦區(qū)特異性敲除NR1基因的小鼠，分別稱iCA1-KO小鼠和iFB-KO小鼠。在這

3、兩種小鼠的染色體中，有4個(gè)基因位點(diǎn)同時(shí)被修飾。通過給小鼠喂食正常食物或含強(qiáng)力霉素（doxycycline，簡(jiǎn)稱dox）的食物，可達(dá)到在時(shí)間上對(duì)NR1基因的敲除進(jìn)行調(diào)控，即給小鼠喂食含dox的食物（6mg／g，下同）5天后，可獲得基因敲除的效果；反之，小鼠體內(nèi)的NMDA受體活性則不受影響。通過原位雜交和免疫染色的方法，證實(shí)喂食dox 5天后，iCA1-KO小鼠中的NR1基因敲除限定在海馬的CA1區(qū)，而iFB-KO小鼠中的NR1基因敲除則限

4、定在前腦區(qū)。 分別運(yùn)用這兩種模型小鼠及其同窩對(duì)照組進(jìn)行隱藏平臺(tái)的水迷宮任務(wù)測(cè)試。iCAl-KO及其對(duì)照組每只小鼠每天訓(xùn)練4次，從水池的不同象限各入水1次，每次間隔1小時(shí)，訓(xùn)練單次的時(shí)間設(shè)定為90秒，連續(xù)實(shí)驗(yàn)14天，并于第8天開始給兩組小鼠喂食dox。實(shí)驗(yàn)過程的第2天、第7天、第13天和第14天進(jìn)行目標(biāo)測(cè)試（probe test）。第1天至第13天訓(xùn)練和測(cè)試時(shí)，水迷宮周圍的線索（cue）完整；第14天測(cè)試時(shí)只保留部分線索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

5、，對(duì)照組與iCAl-KO組小鼠隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加，逃避潛伏期（1atency）逐漸縮短，分別由第1天的77.07±2.91秒和75.86±4.53秒降至第12天的26.67±4.02秒和29.2±4.22秒；且兩組小鼠逃避潛伏期的變化趨勢(shì)一致，沒有顯著差異。在隨后進(jìn)行的4天目標(biāo)測(cè)試中，第2天的測(cè)試結(jié)果顯示，兩組小鼠分布在水池四個(gè)象限中的游動(dòng)時(shí)間相當(dāng)，均為25％左右。第7天的測(cè)試中，兩組小鼠在靶象限中的游動(dòng)時(shí)間均明顯多于其他3個(gè)象限（p<

6、0.001），分別達(dá)到38.48±1.66秒和35.62±1.78秒。在第13天（喂食dox 5天）、第14天（喂食dox 6天，部分線索存在）的測(cè)試中，兩組小鼠在靶象限中的游動(dòng)時(shí)間仍然明顯多于其他3個(gè)象限（p<0.001）；但兩組小鼠之間在各象限中的游動(dòng)時(shí)間則沒有顯著差異。這一結(jié)果提示，在海馬CA1亞區(qū)特異性敲除NR1基因，無論是在完整線索還是在部分線索的情況下，小鼠都能正常地對(duì)已形成的空間記憶加以提取。 為探討不同腦區(qū)神經(jīng)元

7、，的NMDA受體在空間記憶提取中的作用，本文又利用iFB-KO及其對(duì)照組小鼠進(jìn)行水迷宮任務(wù)測(cè)試，其結(jié)果與iCAl-KO及其對(duì)照組小鼠的相似。iFB-KO及其對(duì)照組每只小鼠每天訓(xùn)練4次，從水池不同象限各入水1次，每次間隔1小時(shí)，訓(xùn)練單次的時(shí)間同樣設(shè)定為90秒，連續(xù)實(shí)驗(yàn)16天，并于第10天開始給兩組小鼠喂食dox。實(shí)驗(yàn)過程中的第2天、第7天、第15天和第16天進(jìn)行目標(biāo)測(cè)試。第1天至第15天訓(xùn)練和測(cè)試時(shí)，水池周圍布置的線索是完整的，第16天測(cè)

8、試時(shí)則只保留部分線索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加，對(duì)照組和iFB-KO組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短，分別由第1天的68.28±5.28秒和72.49±3.9秒降至第14天的29.22±6.64秒和27.2±4.27秒；且兩組小鼠逃避潛伏期的變化趨勢(shì)一致，沒有顯著差異。在隨后進(jìn)行的4天目標(biāo)測(cè)試中，第2天的測(cè)試數(shù)據(jù)表明，兩組小鼠分布在水池四個(gè)象限中的游動(dòng)時(shí)間相當(dāng)，均為25％左右。第7天的測(cè)試中，兩組小鼠在靶象限中的游動(dòng)時(shí)間比在其他三個(gè)象限要

9、多，但沒有顯著差異（p>0.1）。第15天（喂食dox 5天）測(cè)試中，兩組小鼠在靶象限中的游動(dòng)時(shí)間均明顯多于其他3個(gè)象限（p<0.001），分別達(dá)到35.03±2.03秒和33.65±2.1秒。第16天（喂食dox6天，保留部分線索）的測(cè)試中，兩組小鼠在靶象限中的游動(dòng)時(shí)間仍然明顯多于右象限和相對(duì)象限，但與左象限的游動(dòng)時(shí)間相比沒有明顯差異；同時(shí)兩組小鼠之間在各象限中的游動(dòng)時(shí)間沒有明顯不同。這一結(jié)果同樣提示，在整個(gè)前腦區(qū)（皮層、海馬、紋狀體

10、等）敲除NR1基因，無論是在周圍的線索全部存在還是部分存在的情況下，與對(duì)照組小鼠相比，iFB-KO小鼠都能正常地對(duì)形成的空間記憶加以提取。 為了進(jìn)一步探討NMDA受體在非陳述性記憶提取中的作用，本文還利用條件性味覺厭惡回避任務(wù)（CTA）對(duì)iFB-KO及其對(duì)照組小鼠進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行35天，前5天為適應(yīng)期，使小鼠由自由飲水改為定時(shí)飲水。第6天飲水時(shí)間將普通水換成糖精鈉（0.1％w/v），飲水結(jié)束后40分鐘給小鼠腹腔注射LiC

11、l。其后28天恢復(fù)給予普通飲用水，并于測(cè)試前6天開始將普通鼠食換成含dox的食物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅在測(cè)試階段敲除前腦的NR1基因，兩組小鼠對(duì)水的傾向因子分別為71.27±3.76％和71.86±2.68％，沒有顯著差異。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次表明，僅在測(cè)試階段敲除整個(gè)前腦的NMDA受體基因，小鼠對(duì)不依賴于海馬的味覺記憶（非陳述性記憶的一種）的提取也能正常進(jìn)行。 利用可誘導(dǎo)、可反轉(zhuǎn)的條件基因剔除小鼠，本文首次直接研究了NMDA受體在空間記憶