缺氧誘導Neuroglobin上調的調控機制和以Neuroglobin為靶分子篩選神經保護藥物的研究.pdf

1、第一部分：缺氧誘導Neuroglobin上調的調控機制
　　 Neuroglobin(Ngb)是新近發(fā)現(xiàn)的神經特異性表達的攜氧蛋白，主要在脊椎動物神經組織中高表達。以前的研究表明，缺氧可以誘導大腦中Ngb基因的表達的上調，而增加Ngb的表達可以進一步保護大腦免受缺血缺氧引發(fā)的損傷。然而，Ngb在缺氧條件下的調控機制尚不是很清楚。在這個研究中，我們發(fā)現(xiàn)小鼠Ngb基因的近端啟動子約554bp的序列高度保守，并且這段區(qū)域包含幾個保守的

2、NFκB和Egr1結合位點。過表達或者干擾轉錄因子p65，p50，Egr1或者Sp1能夠增加或者降低Ngb基因的表達。Ngb基因啟動子區(qū)域轉錄因子結合位點突變研究以及凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)和染色體免疫沉淀實驗證明了NFκB家族成員(包括p65，p50和cRe1)以及Egr1和Sp1能夠與Ngb基因的啟動子區(qū)域結合。而且，我們研究發(fā)現(xiàn)一個κB3位點作為一個關鍵的順式作用原件介導了缺氧條件下誘導Ngb基因啟動子活性的上調。轉錄

3、因子NFκB(p65)，Sp1參與了調控缺氧條件下Ngb基因的表達上調。盡管我們在小鼠Ngb基因的近端啟動子區(qū)域并沒有發(fā)現(xiàn)HIF1α的保守結合位點，但是我們的結果表明HIF1α也參與了缺氧條件下Ngb基因的表達上調。因此，從這些結果中我們得出結論：轉錄因子NFκB，Egr1，Sp1通過與小鼠Ngb基因啟動子特異性的結合參與了對Ngb基因的調控，而NFκB，Sp1以及HIF1α參與了缺氧條件下小鼠Ngb基因的調控。
　　 第二部分

4、：以Neuroglobin為靶分子篩選神經保護藥物研究
　　 中風是引起人類死亡的主要疾病之一。以前的研究表明Ngb是一個能保護神經免受缺血缺氧，氧壓以及神經退行性病變的新的內源性神經保護蛋白。因此，上調Ngb的表達可能能作為一種干預和治療中風以及相關性疾病的潛在的治療方法。為了篩選能夠上調Ngb表達的自然化合物，我們分別克隆了人以及小鼠約2kb的Ngb啟動子并構建進入報告基因載體，然后進一步分別建立了人以及小鼠具有Ngb啟動子

5、報告基因的穩(wěn)定表達系。為了鑒定我們的人以及小鼠的穩(wěn)定表達系，我們初步篩選了一個包含約40個化合物的文庫。我們發(fā)現(xiàn)：Polydatin，Icariin，Genipin，Genistein，Daidzein，BiochaninA，F(xiàn)ormononetin能夠在小鼠的穩(wěn)定表達系中上調小鼠的Ngb基因啟動子活性。而Polydatin，Genistein，Daidzein，BiochaninA，F(xiàn)ormononetin能夠在人的穩(wěn)定表達細胞系中上

6、調人的Ngb基因啟動子活性。通過RT-PCR和Western blotting我們進一步確認了Polydatin，Genistein，F(xiàn)ormononetin能夠顯著的上調NgbmRNA水平和蛋白水平。而且我們的結果表明Polydatin和Formononetin能夠減少OGD誘導的神經元的死亡。因此，我們的結果說明Polydatin和Formononetin可能可以作為潛在的神經保護藥物，并且我們構建的人和小鼠Ngb基因報告基因表達系