系統(tǒng)性硬化癥患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在Treg-Th17細(xì)胞關(guān)系失衡中的作用及FK506對其影響的研究.pdf

1、第一部分，系統(tǒng)性硬化癥患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在Treg/Th17關(guān)系失衡中的作用
　　 目的：
　　 觀察初治系統(tǒng)性硬化癥(SSc)患者外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)水平及其表型、亞群和功能的變化，探討Treg在SSc患者Treg和Th17細(xì)胞間失衡中的作用。
　　 材料與方法：
　　 提取SSc患者（31例）和健康對照（33例）的PBMC，標(biāo)記CD4、CD25、FoxP3及CD4

2、5RA、CTLA-4、CD69、PD-1、GITR、IL-17熒光標(biāo)記抗體，用流式細(xì)胞術(shù)分析Treg及其表型和亞型的變化；分選Treg細(xì)胞及其亞群，用淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)法鑒定免疫抑制功能；提取Treg細(xì)胞及其亞群mRNA，用real-timePCR法檢測FoxP3、CTLA-4、IL-17A和RORCmRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1)SSc患者PBMC中的CD4+CD25+FoxP3+Treg水平高于對照組(3

3、.62±1.14vs1.97±0.75，P＜0.001)；SSc患者Treg細(xì)胞中CTLA-4的表達(dá)低于對照組(P=0.034)，而CD69、PD-1和GITR的表達(dá)與對照組沒有差異；SSc患者Treg細(xì)胞中FoxP3和CTLA-4mRNA的表達(dá)均較對照組降低(P＜0.05)；SSc組Treg的免疫抑制功能低于對照組(P=0.034)。
　　 (2)SSc患者CD4+細(xì)胞中CD45RA-FoxP3highactivatedTre

4、g細(xì)胞(aTreg，F(xiàn)rⅡ)亞群明顯下降(0.25±0.16vs0.66±0.41amongCD4+,P<0.001;12.42±5.23vs30.01±1.74amongTreg，P＜0.001)，CD45RA-FoxP3lo非抑制性T細(xì)胞(FrⅢ)亞群顯著升高(6.23±2.29vs2.90±0.91amongCD4+,P＜0.001;73.71±9.62vs57.96±9.90amongTreg，P＜0.001)，CD45RA+F

5、oxP3lorestingTreg細(xì)胞(rTreg，F(xiàn)rⅠ)亞群雖無升高，但其在Treg細(xì)胞中的比例明顯下降(1.87±0.94vsl.63±0.97amongCD4+，P=0.320;23.19±10.60vs29.63±11.77amongTreg，P=0.025);在對照組，F(xiàn)rⅡ的免疫抑制能力明顯優(yōu)于FrⅠ(P=0.025);但在SSc組，F(xiàn)rⅡ與FrⅠ的免疫抑制功能相似(P=0.974)，且這兩群的功能均分別低于健康對照組(P

6、=0.011，P＜0.001);無論對照組還是SSc組，F(xiàn)rⅢ幾乎沒有免疫抑制功能。
　　 (3)CTLA-4及其mRNA在SSc患者FrⅡ和FrⅢ亞群中的表達(dá)明顯下降(P＜0.001，respectively)，在FrⅠ亞群中的表達(dá)與對照組無差異；在對照組，F(xiàn)rⅡ亞群中CTLA-4的表達(dá)明顯高于FrⅠ、FrⅢ及CD4+CD25-T細(xì)胞(P＜0.001，respectively)，而在SSc組，F(xiàn)rⅡ和FrⅠ亞群中CTLA-4的

7、表達(dá)沒有差異。
　　 (4)無論SSc組還是對照組，F(xiàn)rⅢ亞群中IL-17的表達(dá)明顯高于FrⅠ和FrⅡ(P＜0.001，respectively)，但兩組間IL-17在FrⅢ亞群中的表達(dá)無差異；SSc患者Th17細(xì)胞明顯高于對照組(P＜0.001)；SSc患者CD25+FoxP3+IL17+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中所占比例高于對照組(0.075±0.032vs0.049±0.027，P=0.029)，而CD25+FoxP3+IL17

8、-與對照組無差異。SSc患者FrⅢ亞群中IL-17A和RORCmRNA的表達(dá)亦高于對照組(P＜0.001，respectively)。
　　 結(jié)論：
　　 SSc患者PBMC中Treg水平升高，但功能存在缺陷；SSc患者Treg細(xì)胞中，aTreg明顯下降，同時伴有功能的缺陷，這種缺陷與CTLA-4有關(guān)；SSc患者CD45RA-FoxP3loT細(xì)胞明顯升高，該亞群沒有免疫抑制功能，具有FoxP3+IL-17+co-expr

9、ess的特性；aTreg降低和CD45RA-FoxP3loT細(xì)胞的升高，是SSc患者Treg水平升高而功能缺陷的主要原因，也是SSc患者Treg與Th17細(xì)胞間失衡的主要原因。
　　 第二部分，F(xiàn)K506對系統(tǒng)性硬化癥患者外周血Treg及Treg/Th17細(xì)胞失衡關(guān)系影響的初探
　　 目的：
　　 觀察FK506對初治系統(tǒng)性硬化癥患者PBMC中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及其亞群水平和增殖能力的影響，初步探討FK5

10、06對SSc患者Treg細(xì)胞及Treg和Th17細(xì)胞間失衡關(guān)系的調(diào)節(jié)作用。
　　 材料與方法：
　　 提取SSc患者（5例）和健康對照（6例）的PBMC，以0ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、和10ng/ml的FK506進(jìn)行干預(yù)，標(biāo)記CD4、CD25、FoxP3及CD45RA、IL-17熒光標(biāo)記抗體，用流式細(xì)胞術(shù)分析Treg及其亞群的變化；對PBMC和分選所得CD4+細(xì)胞標(biāo)記CFSE，以0ng/ml、0.1ng

11、/ml、1ng/ml、和10ng/ml的FK506進(jìn)行干預(yù)，標(biāo)記CD25、FoxP3及CD45RA熒光標(biāo)記抗體，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞增殖水平；用FlowCytoMix法檢測血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A、IL-22、IL-6和IL-1β的水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1)FK506對健康對照組的CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞水平?jīng)]有影響，但中高濃度的FK506能夠降低SSc患者Treg的水平；
　　

12、 (2)FK506能夠降低健康對照和SSc患者FrⅠ細(xì)胞的水平，但對FrⅠ在Treg細(xì)胞中的比例沒有影響，F(xiàn)K506對健康對照和SSc患者FrⅡ細(xì)胞水平?jīng)]有影響，但能夠相對增加FrⅡ在Treg細(xì)胞中的比例，F(xiàn)K506能夠顯著降低健康對照和SSc患者FrⅢ細(xì)胞的水平；
　　 (3)SSc患者血清中IL-17A、IL-22、IL-6和IL-1β水平顯著增高，F(xiàn)K506能夠顯著降低健康對照和SSc患者Th17細(xì)胞和FoxP3+IL-1

13、7+細(xì)胞水平，能夠顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A和IL-1β的水平；
　　 (4)FK506能夠顯著降低CD4+細(xì)胞的增殖能力，但對FoxP3+細(xì)胞的影響小于對FoxP3-細(xì)胞的影響，F(xiàn)K506對SSc患者FrⅠ細(xì)胞和FrⅡ細(xì)胞的增殖能力沒有影響，但能夠顯著的降低FrⅢ細(xì)胞的增殖能力。
　　 結(jié)論：
　　 SSc患者aTreg降低和CD45RA-FoxP3loT細(xì)胞的升高，是SSc患者Treg水平升高而功能缺