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文檔簡(jiǎn)介
1、流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)又稱日本腦炎,簡(jiǎn)稱乙腦,是由乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一種急性人獸共患傳染病。JEV屬于黃病毒科(Flaviridae)黃病毒屬(Flavivirus),為單股正鏈RNA病毒。本研究根據(jù)已發(fā)表的JEV減毒株SA14-14-2全基因序列設(shè)計(jì)合成5對(duì)引物,擴(kuò)增出覆蓋JEV仝基因的5個(gè)片段,并成功克隆至pEASY-Blu
2、nt載體上,經(jīng)測(cè)序拼接獲得JEV全基因組序列。結(jié)果表明,JEV全基因組長(zhǎng)10977 bp,除5'端95個(gè)核苷酸和3'端385個(gè)核苷酸為非編碼區(qū)以外,其余10296個(gè)核苷酸編碼一個(gè)丌放閱讀框(ORF),依次編碼以下蛋白:C、PrM、E三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。將此全序列與已發(fā)表的SA14源毒株核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行比較分析,其同源性均為99%以上。并發(fā)現(xiàn)10701位有堿基G
3、的插入,多數(shù)其他已發(fā)表的序列均有此情況發(fā)生,這可能是傳代過程中為適應(yīng)環(huán)境而引起的自然突變。測(cè)定SA14-14-2株全基因序列,不僅為開展基因工程疫苗研究奠定基礎(chǔ),為應(yīng)用于生產(chǎn)的減毒活疫苗的質(zhì)控提供了寶貴的材料,也為進(jìn)一步構(gòu)建感染性克隆奠定工作基礎(chǔ)。
納米PCR技術(shù)是一種新型的PCR技術(shù),其原理是把粒徑為1 nm~100nm的固相納米金屬顆粒懸浮在液體中形成納米流體。JEV的E基因編碼JEV的囊膜糖蛋白(envelope gly
4、coprotein),E蛋白是病毒顆粒表面最重要的成分,有多個(gè)抗原表位,在病毒入侵宿主中起到重要作用。本研究根據(jù)JEV E基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增270 bp片段的特異性檢測(cè)引物,將納米金顆粒添加到PCR反應(yīng)體系中,同時(shí)優(yōu)化反應(yīng)條件,首次建立了高效、靈敏的納米PCR檢測(cè)方法。采用該方法靈敏度可達(dá)1.96×102 copies,普通PCR方法僅為1.96×104 copies,且與其他病毒沒有交叉感染。由丁納米材料具有良好的熱傳導(dǎo)性,因
5、此在添加了納米金顆粒的PCR循環(huán)體系中,PCR反應(yīng)會(huì)更快地達(dá)到目標(biāo)溫度,減少了在非目標(biāo)溫度的停留時(shí)間,進(jìn)而縮短整個(gè)體系達(dá)到溫度平衡所用的時(shí)問,減少非特性擴(kuò)增,提高特異性擴(kuò)增產(chǎn)量。通過試驗(yàn)研究表明,該納米PCR檢測(cè)方法不僅特異性好,而且其敏感性是普通PCR檢測(cè)方法的100倍。果用納米PCR方法和普通PCR方法對(duì)臨床送檢的32份樣品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果納米PCR檢出2份陽(yáng)性樣品,普通PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性。研究表明,該檢測(cè)方法不僅為JEV的檢測(cè)提
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