BEV-3D-ELISA的建立及其在牛腸道病毒陽(yáng)性個(gè)體篩選中的應(yīng)用.pdf

1、牛腸道病毒是小RNA病毒科腸道病毒屬的成員之一，外觀呈球形，正二十面體結(jié)構(gòu)，無(wú)包膜，大小約為25～30nm，病毒的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長(zhǎng)7.5kb。BEV第一次由Kunin和Mcferran在1957年從健康牛群的糞便中分離得到，隨后全世界陸續(xù)報(bào)道了該病毒分離株，但在我國(guó)有關(guān)該病毒的流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道甚少。牛腸道病毒的宿主嗜性比較廣泛，包括羊、犬、人等，目前為止該病毒的病原學(xué)研究并不明確，致病機(jī)理仍不清楚，臨床癥狀有時(shí)會(huì)出

2、現(xiàn)腹瀉、繁殖障礙性疾病等，有時(shí)也侵入其它器官引起臨床綜合征。
　　本研究以本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存的BEV-3531株基因序列為參考序列設(shè)計(jì)針對(duì)3D基因的特異性引物，采用PCR方法擴(kuò)增得到3D基因，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pEASY Blunt Simple Vector(pBsK)，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證該序列為目的片段后，將其克隆到表達(dá)載體pET-30a，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE顯示重組蛋白在大腸桿菌中

3、高效表達(dá)，以Ni-NTA柱親和層析法純化蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)初步純化后，以3D免疫家兔獲得了高效價(jià)多克隆抗體，通過(guò)Western blotting與間接免疫熒光結(jié)果得出3D蛋白具有很好的抗原性。
　　將純化好的3D蛋白作為包被抗原，建立了BEV-3D-ELISA方法并進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，通過(guò)重復(fù)性與特異性試驗(yàn)結(jié)果證明本研究建立的I-ELISA特異性、穩(wěn)定性良好。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用本方法對(duì)哈爾濱市送檢的425份奶牛血清進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示3D蛋

4、白與感染牛群血清可以發(fā)生特異性反應(yīng)且陽(yáng)性率高達(dá)41.41％。
　　為了揭示動(dòng)物感染牛腸道病毒后體內(nèi)的3D抗體水平與病毒存在的相關(guān)性，利用BEV-3D-ELISA方法檢測(cè)BEV-3531株病毒感染乳鼠后的3D抗體消長(zhǎng)規(guī)律，同時(shí)用RT-PCR檢測(cè)感染鼠腸組織中的病毒核酸;另外，用建立的BEV-3D-ELISA方法檢測(cè)了哈爾濱市某奶牛群第一批血清樣本42份，同時(shí)將42份相應(yīng)奶牛的糞便樣品進(jìn)行處理后接種于MDBK細(xì)胞并觀察病變情況，然后對(duì)

5、發(fā)生病變的細(xì)胞上清進(jìn)行RT-PCR、連接、轉(zhuǎn)化與序列測(cè)定，最后將病變的樣品通過(guò)掃描電鏡進(jìn)行病毒形態(tài)學(xué)鑒定;為了防止上述試驗(yàn)的偶然發(fā)生性又對(duì)哈爾濱市同一牛群的血清與糞便樣品22份進(jìn)行了相同試驗(yàn)。結(jié)果表明動(dòng)物感染試驗(yàn)中感染動(dòng)物體內(nèi)可檢測(cè)出病毒的時(shí)間范圍與3D抗體存在的時(shí)間范圍符合性良好，都是呈現(xiàn)先上升再降低的趨勢(shì);BEV-3D-ELISA臨床檢測(cè)結(jié)果顯示第一批42份血清中10份為陽(yáng)性，第二批22份血清中4份為陽(yáng)性，RT-PCR結(jié)果顯示第一批