抗豬氨基肽酶單克隆抗體的制備及阻斷氨基肽酶受體功能的分析.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)和豬傳染性胃腸炎(TransmissibleGastroenteritis，TGE)這使兩種病毒是哺乳仔豬高致死率的主要原因，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。如何有效防治這兩種疾病是當前亟待解決的問題，而對相關致病機理的研究可為有效防治提供理論依據(jù)。豬氨基肽酶(porcine aminopeptidaseN，pAPN)是一類鋅離子依賴性的膜結合Ⅱ型金屬糖蛋白，存

2、在于細胞表面，廣泛分布于哺乳動物的多種組織細胞的表面，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸膜、粒細胞和單核細胞、腎近曲小管上皮和肺臟細胞表面都有高水平的表達，尤其在小腸微絨毛表面大量存在，主要功能是水解肽、酰胺等結構中的酰胺鍵，從而釋放出不同的N-中性氨基酸。APN作用的天然底物包括血管作用肽、神經(jīng)肽激素、細胞因子和免疫調(diào)節(jié)劑等，因此它能參與很多重要過程的深度反應。研究發(fā)現(xiàn)，PEDV和TGEV均以pAPN作為細胞感染受體，同時pAPN的抗體可以有效阻斷

3、pAPN與PEDV和TGEV的結合。因此，制備抗pAPN抗體及對其生物學特性的分析可以為有效防治PED和TGE提供理論依據(jù)和試驗數(shù)據(jù)。
　　本研究以天然pAPN蛋白免疫BALB/c小鼠，按常規(guī)方法進行融合，通過間接ELISA方法篩選，最終獲得2株抗pAPN的雜交瘤細胞系（命名為3E5和2E3），這兩株細胞分泌的抗體亞類分別為IgG1和IgM，效價分別為1∶1000和1∶500。通過Western blot證實3E5株和2E3株分泌

4、的抗體是針對pAPN的SPC段（pAPN500aa-963aa段），且與天然pAPN可發(fā)生特異性結合，免疫熒光實驗證實3E5株和2E3分泌的抗體可以與IEC-2細胞和PK-15細胞上的天然pAPN蛋白發(fā)生特異性結合。將抗pAPN的單克隆抗體與IEC-2細胞和PK-15細胞作用后，再分別感染PEDV和TGEV，于接毒后24h、48h、72h在顯微鏡下觀察病變效果，結果表明，抗pAPN的單抗可有效阻斷pAPN受體，且IEC-2細胞和PK-1

5、5細胞病變均被不同程度的抑制。進一步收取吸附后、病毒感染24h和病毒感染48h的細胞感染物，提取RNA，通過熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù)，并對這三組樣品進行顯著性分析。結果表明，經(jīng)pAPN單克隆抗體作用后，細胞感染物中的病毒拷貝數(shù)顯著降低，表明抗pAPN單抗有效地阻斷了pAPN受體與病毒的結合，并進一步抑制了病毒的繁殖。將pAPN單克隆抗體分別做1∶10、1∶100和1∶1000倍稀釋，將不同稀釋度的pAPN單抗分別與IEC-2細胞和P

6、K-15細胞作用后，再接種PEDV和TGEV，于病毒吸附后，收取細胞感染物，提取RNA，通過熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù)，檢測分析不同濃度pAPN單抗對pAPN受體的阻斷作用。結果表明，不同濃度的pAPN單抗都具有阻斷pAPN受體，抑制pAPN受體與病毒結合，從而抑制病毒在細胞中的吸附的能力，且隨著單抗?jié)舛鹊慕档妥钄嘧饔靡搽S之降低。此外，將抗pAPN的單克隆抗體與IEC-2細胞和PK-15細胞作用后，再分別感染不同拷貝數(shù)的PEDV和TG

7、EV，于病毒吸附后，收取細胞感染物，提取RNA，通過熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù)，檢測分析pAPN單抗對pAPN受體阻斷后對不同濃度病毒增殖的抑制作用。結果表明，pAPN單抗對不同濃度的病毒都具有阻斷作用，且不同濃度病毒組pAPN單抗對pAPN受體的阻斷作用并無明顯差異。
　　以上結果證明，3E5株和2E3株分泌的抗體對pAPN具有較高的特異性和親和性，3E5株可有效阻斷pAPN受體與TGEV的結合，并抑制TGEV在細胞中的感染和