博萊霉素大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞表型與肺纖維化相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell,EC）作為血管壁基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，是血管屏障重要的組成部分，生理狀態(tài)下在調(diào)節(jié)血管內(nèi)外物質(zhì)交換、維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用。在損傷因子的作用下，通過一系列調(diào)控機(jī)制，EC即可發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)以消除致病因子對(duì)機(jī)體的損傷作用，與此同時(shí)，EC通過表型轉(zhuǎn)變參與損傷組織的修復(fù)，如炎癥所致的基底膜損傷或斷裂的重建。一旦其調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生異常，則導(dǎo)致形態(tài)和功能的改變，并可能成為各種疾病發(fā)生

2、的主要啟動(dòng)因素之一。肺急性損傷的發(fā)病過程包括急性肺泡炎期和損傷組織修復(fù)重塑階段，而血管反應(yīng)是炎癥發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，其中EC緊密連接開放、血管通透性增高是炎癥反應(yīng)的主要表現(xiàn)形式，它不僅為清除損傷因子及壞死組織提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且為損傷組織的重建提供了保證。隨著組織修復(fù)的完成，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）的功能恢復(fù)正常。但是我們前期研究顯示，博萊霉素

3、（bleomycin,BLM）損傷大鼠PMVECs間緊密連接(tight junction,TJ)卻持續(xù)開放，即使肺間質(zhì)基質(zhì)已過度沉積，PMVECs的TJ仍未能恢復(fù)正常。這種內(nèi)皮屏障功能的異常為纖維化發(fā)生時(shí)單核細(xì)胞游出并釋放各種致纖維化生長(zhǎng)因子提供了途徑。在PF發(fā)生過程中，成纖維細(xì)胞（fibroblast,Fb）轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast,MFb）是關(guān)鍵的細(xì)胞事件之一。在Fb轉(zhuǎn)化的過程中，細(xì)胞因子及其形成的網(wǎng)絡(luò)起著重

4、要的作用。我們的前期研究表明，不同致病因子均可引起幾乎相同的細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)，而且在致纖維化過程中起著重要作用的細(xì)胞因子，如TGF-β1、CTGF、IGF等在正常生理代謝中亦有表達(dá)，提示相關(guān)的細(xì)胞因子不僅在致纖維化中有異常表達(dá)，而且是細(xì)胞正常生理代謝中不可或缺的調(diào)控因素。已經(jīng)證實(shí)，細(xì)胞因子的表達(dá)與細(xì)胞的功能密切相關(guān)，如作為血細(xì)胞主要成分之一的單核細(xì)胞并不具備分泌細(xì)胞因子的功能，但當(dāng)其游走至組織間或肺泡時(shí)則轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袕?qiáng)大分泌功能的巨噬細(xì)

5、胞。單核細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變?cè)诳菇M織損傷中起著重要作用。EC是分泌CTGF的細(xì)胞之一，它具有促進(jìn)Fb轉(zhuǎn)化為MFb的作用。在損傷因子作用下，EC間TJ開放意味著其形態(tài)和功能已發(fā)生明確改變，但是BLM損傷大鼠肺EC間的TJ持續(xù)開放似提示PMVECs表型轉(zhuǎn)變的調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂。在此基礎(chǔ)上，表型發(fā)生改變的PMVECs分泌CTGF的功能是否發(fā)生異常，并成為PF形成的主要誘發(fā)因素之一，目前未見報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)通過光鏡、電鏡、ELISA檢測(cè)法及免疫組織化學(xué)染色

6、等方法，觀察肺炎及PF大鼠肺組織的病理過程及PMVECs形態(tài)學(xué)改變，比較兩組血清CTGF的含量及時(shí)相變化趨勢(shì)和兩組大鼠肺組織MVECs的CTGF表達(dá)情況，分析BLM損傷大鼠PMVECs形態(tài)、功能的改變與CTGF表達(dá)的關(guān)系，以探討PMVECs表型與PF發(fā)生的關(guān)系。
　　方法：
　　SD大鼠45只，體重150±20g，雌雄不拘（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。隨機(jī)分為3組，即BLM組、肺炎鏈球菌組、正常組，每組15只。BLM組用博萊

7、霉素-A5的溶液（天津太河制藥有限公司出品，8mg/支，批號(hào)040902）用生理鹽水配成4g/L溶液，按5mg/kg給藥注入氣管。注入過程中將大鼠直立、旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻。肺炎組在相同條件下向氣管內(nèi)注入肺炎鏈球菌菌液0.15mL/只（中國(guó)藥品生物制品檢定所出品，細(xì)菌號(hào)31003，復(fù)蘇繁殖2代，稀釋成菌液，菌落數(shù)3×108/mL）。正常組在相同條件下向氣管內(nèi)注入0.25mL的生理鹽水，方法同上。分別于給藥后第3，7，14，2

8、1和28d處死大鼠，經(jīng)右室流出道用生理鹽水沖洗致大鼠肺發(fā)白后，取肺組織用10g/L多聚甲醛固定后石蠟包埋、切片，HE、VG染色；取少量各組肺組織用3％的戊二醛固定后制作成電鏡標(biāo)本，觀察PMVECs形態(tài)學(xué)改變。ELISA法檢測(cè)各組血清CTGF含量及其時(shí)相變化趨勢(shì)。免疫組織化學(xué)染色采用兩步法檢測(cè)觀察對(duì)比各組大鼠肺間質(zhì)中CTGF在PMVECs中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、肺炎與BLM組光鏡觀察：肺炎組第3d肺間質(zhì)內(nèi)見大量炎細(xì)

9、胞，肺泡腔結(jié)構(gòu)消失呈片狀實(shí)變區(qū)，第14d肺通氣基本恢復(fù)正常；BLM組第3d肺泡腔滲出性改變，肺泡間隔炎細(xì)胞浸潤(rùn)，第14d、21d肺泡間隔增厚明顯，實(shí)變區(qū)明顯增多，間質(zhì)Fb增多，第28d肺泡間隔增厚，可見大量膠原纖維。
　　2、PMVECs超微結(jié)構(gòu)觀察：肺炎組第7d PMVECs呈增生狀態(tài)，緊密連接開放，胞質(zhì)厚度增加，吞飲小泡明顯減少，之后恢復(fù)正常；BLM組PMVECs表面不光整，表面可見指狀突起及血小板粘附，體積增大呈增生狀態(tài)，第

10、7、14、21d細(xì)胞內(nèi)吞飲小泡明顯持續(xù)增多，且緊密連接持續(xù)開放，第28d PMVECs旁大量膠原沉積。
　　3、血清CTGF測(cè)定：肺炎組第3d增高，第7d驟降，之后恢復(fù)正常（12.06±0.43pg/mL）；BLM組第7d開始增高，第21d增至高峰(19.45±0.41pg/mL)，組間差異明顯（n=15, p<0.05），兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、免疫組化染色：BLM組第21d大鼠肺組織CTGF陽性表達(dá)較肺炎組

11、第21d明顯增高，肺間質(zhì)MVECs的CTGF陽性表達(dá)明顯（n=15，p<0.05），兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、BLM可致大鼠PMVECs形態(tài)改變及功能紊亂，PMVECs表型轉(zhuǎn)變是CTGF時(shí)相和量異常表達(dá)的關(guān)鍵因素之一，它可能是BLM所致PF發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。
　　2、基于PMVECs由“屏障表型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤笆湛s”表型與EC代謝密切相關(guān)，[Ca2+]i代謝調(diào)節(jié)功能紊亂可能是EC表型轉(zhuǎn)變及EC異常分