博萊霉素大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能變化與肺纖維化相關(guān)性研究.pdf

1、目的：EC作為血管基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，其重要的生理功能就是發(fā)揮其屏障功能，調(diào)節(jié)血管內(nèi)外的物質(zhì)交換，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使得鄰近或遠(yuǎn)端的組織器官免受損害。細(xì)胞外基質(zhì)與EC粘附形成完整的內(nèi)皮屏障。在PF的發(fā)病過程中，起始階段的肺泡炎和纖維化形成階段均有血管通透性增高、EC間連接持續(xù)開放。這種內(nèi)皮屏障功能的異常為大分子物質(zhì)跨內(nèi)皮交換提供了旁路途徑，對(duì)肺損傷時(shí)炎癥細(xì)胞進(jìn)入肺泡、肺間質(zhì)及激活Fb增殖具有重要意義。EC連接蛋白與肌動(dòng)蛋白相連，與細(xì)胞

2、骨架一起受細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]I的影響。本實(shí)驗(yàn)通過電鏡、細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組化、激光共聚焦掃描技術(shù)，觀察肺炎及PF大鼠PMVEC形態(tài)學(xué)改變，比較PF及正常大鼠PMVEC內(nèi)[Ca2+]I差異，并分析其負(fù)反饋調(diào)節(jié)因素—中電導(dǎo)鈣激活鉀通道蛋白質(zhì)1（Kca3.1）的表達(dá)特點(diǎn)，探討博萊霉素?fù)p傷時(shí)大鼠肺PMVEC屏障功能變化和機(jī)制以及PMVEC在PF發(fā)生中的地位和作用。 方法： SD大鼠20 只，體重150±20 g，雌雄不拘（第四軍醫(yī)大

3、學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。隨機(jī)分為對(duì)照組和博萊霉素組(BLM組)，每組各10 只。博萊霉素A5（天津太河制藥，8mg/支，批號(hào)041103）用生理鹽水稀釋成4 g/L，按5 mg/kg體重氣管內(nèi)滴入0.15~0.2 ml制作PF模型，對(duì)照組氣管內(nèi)滴入等量生理鹽水。兩組分別行PMVEC原代培養(yǎng)，以100 μL Fluo-3 /AM熒光指示劑（美國MolecularProbe公司）負(fù)載，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]I熒光強(qiáng)度，應(yīng)用免疫

4、細(xì)胞化學(xué)法及免疫熒光法分別測(cè)定Kca3.1 在EC的表達(dá)。透射電鏡觀察肺炎、BLM組及對(duì)照組PMVEC形態(tài)（電鏡標(biāo)本由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院放射科殷茜博士提供）。 結(jié)果： 1. 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞透射電鏡觀察 ① EC 緊密連接：對(duì)照組EC 管腔面光滑，沒有鑭顆粒附著，緊密連接未見開放。肺炎7 d 組EC 腔面有少量絮狀鑭顆粒，緊密連接開放，EC 呈增生狀態(tài)。肺炎14 d 組恢復(fù)光滑表面，未見鑭顆粒附著，EC 恢復(fù)正

5、常狀態(tài)，EC 周圍有少量膠原沉積。BLM 各組緊密連接持續(xù)開放，EC 腔面可見絮狀、線狀鑭顆粒及血小板附著。EC 表面不光整，可見指狀突起，EC 呈增生狀態(tài)，以7d 、14 d、21 d 組明顯。 ② EC 吞飲小泡：肺炎7 d 組EC 內(nèi)吞飲小泡明顯減少，而BLM 各組吞飲小泡均較豐富，特別是BLM 7 d 組，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量吞飲小泡，且體積增大。EC 旁可見較多膠原沉積，局部EC 與Fb 直接接觸。 2. 肺微血管內(nèi)

6、皮細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+主要位于細(xì)胞漿。內(nèi)皮細(xì)胞[Ca2+]iBLM組（166.56±24.17）明顯高于對(duì)照組（95.79±13.51，p<0.01)，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義3. 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Kca3.1 主要表達(dá)在細(xì)胞膜上。間接免疫熒光法BLM 組Kca3.1（679.29±206.98）明顯低于對(duì)照組（958.75±188.84，p<0.01)；免疫細(xì)胞化學(xué)法BLM 組Kca3.1 （ 169.08±14.81 ）明顯低于對(duì)照

7、組（189.78±13.73，p<0.01)，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1. 血管通透性增高、EC粘附性增加及EC轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)提示BLM組PMVEC的血管屏障功能發(fā)生異常，是炎癥細(xì)胞及血管活性物質(zhì)進(jìn)入組織間的重要因素之一。 2. EC內(nèi)鈣過載是PMVEC屏障功能異常的重要原因，EC[Ca2+]I過載與EC表型轉(zhuǎn)換及EC功能變化密切相關(guān)。 3. PMVEC 細(xì)胞膜中電導(dǎo)鈣激活鉀通道蛋白質(zhì)1 活性