肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能表型變化與博萊霉素大鼠肺纖維化相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是機(jī)體對(duì)肺組織損傷的過度修復(fù)和重塑的病理結(jié)果，而肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts,MFbs）正是導(dǎo)致膠原大量分泌、組織過度修復(fù)的主要效應(yīng)靶細(xì)胞，其在間質(zhì)中數(shù)量增加并持續(xù)活化被認(rèn)為是病程向纖維化進(jìn)展的重要標(biāo)志。MFbs主要由間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞（fibroblasts,Fbs）轉(zhuǎn)化而來，后者在缺氧、促纖維化細(xì)胞因子等因素的誘導(dǎo)下表達(dá)MFbs的特征性蛋白分子——

2、α-SMA，從而轉(zhuǎn)化為MFbs，發(fā)揮更強(qiáng)的致纖維化作用，因此，大量活化的Fbs轉(zhuǎn)化為致纖維化能力更強(qiáng)的MFbs的病理過程是PF進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；仡櫸墨I(xiàn)發(fā)現(xiàn)，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）作為血管壁基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，是血管屏障的重要組成部分，它不僅在生理狀態(tài)下調(diào)節(jié)血管內(nèi)外的物質(zhì)交換、穩(wěn)定機(jī)體的內(nèi)環(huán)境；還在病理狀態(tài)下超早期的發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)。

3、然而，它在消除致病因子對(duì)機(jī)體損傷的同時(shí)也可能由于某種原因而過度地發(fā)揮了介導(dǎo)免疫、炎癥反應(yīng)，加重組織缺氧，分泌過量細(xì)胞因子等生物學(xué)作用，從而促進(jìn)了組織的纖維性修復(fù)。文獻(xiàn)顯示，上述病態(tài)的PMVECs功能可能在Fbs向MFbs轉(zhuǎn)化的病理過程發(fā)揮著重要作用，本實(shí)驗(yàn)將采用ELISA、Western Blot、RT-PCR等方法檢測(cè)PMVECs中相關(guān)細(xì)胞因子的合成、分泌水平，并使用millicell細(xì)胞共培養(yǎng)體系，結(jié)合抗體中和試驗(yàn)，研究體外共培養(yǎng)條

4、件下，BLM大鼠PMVECs對(duì)Fbs的生物學(xué)作用及其機(jī)制，進(jìn)一步揭示PMVECs及其功能表型變化在PF早期病程中的作用。
　　方法：
　　SD大鼠，體重100±20g，雄性，以博萊霉素（Bleomycin，BLM）-A5溶液氣管內(nèi)灌注的方法誘導(dǎo)大鼠PF模型，并在相同條件下向正常大鼠氣管內(nèi)灌注等體積生理鹽水作為對(duì)照。分別于給藥后第3，7，14，21和28天處死大鼠，取外周肺組織留作原代培養(yǎng)PMVECs和Fbs，其余肺組織用10

5、g/L多聚甲醛固定后石蠟包埋、切片、VG染色。在各時(shí)間點(diǎn)原代培養(yǎng)PMVECs和Fbs后，利用ELISA、Western Blot、RT-PCR等方法檢測(cè)各組大鼠PMVECs合成、分泌細(xì)胞因子TGF-β1及CTGF的水平；并將各組大鼠PMVECs分別與預(yù)先培養(yǎng)、傳代的對(duì)照組大鼠Fbs共培養(yǎng)，采用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定、PCNA免疫組化染色、流式細(xì)胞染色、Western Blot等方法，檢測(cè)共培養(yǎng)后的Fbs的增殖、轉(zhuǎn)化及膠原合成能力，并以單培養(yǎng)的

6、各組大鼠Fbs的相應(yīng)功能作為陽性對(duì)照，進(jìn)行比較分析；結(jié)合細(xì)胞因子抗體中和試驗(yàn)檢測(cè)PMVECs細(xì)胞因子分泌功能的變化與其促Fbs增殖、轉(zhuǎn)化功能的相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、BLM大鼠PMVECs的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較對(duì)照組大鼠PMVECs提前。
　　2、免疫熒光染色及WesternBlot檢測(cè)證實(shí)BLM誘導(dǎo)大鼠PF過程中PMVECs上調(diào)TGF-β1和CTGF蛋白的表達(dá)，且高峰出現(xiàn)在BLM氣管內(nèi)灌注后7天組PMVECs。經(jīng)RT

7、-PCR鑒定，BLM氣管內(nèi)灌注后7天組PMVECs中TGF-β1和CTGF的轉(zhuǎn)錄顯著升高。ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)，各組PMVECs培養(yǎng)上清中TGF-β1和CTGF的分泌水平與WesternBlot檢測(cè)的細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平基本一致。
　　3、細(xì)胞免疫熒光染色及WesternBlot檢測(cè)證實(shí)BLM大鼠PMVECs中出現(xiàn)α-SMA蛋白的表達(dá)，其高峰亦位于BLM氣管內(nèi)灌注后7天組。
　　4、生長(zhǎng)曲線及PCNA染色顯示與BLM氣管內(nèi)

8、灌注后7、14、21、28天組PMVECs共培養(yǎng)的Fbs的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期提前，核增殖能力明顯高于對(duì)照組。流式細(xì)胞染色及Western Blot結(jié)果顯示與BLM氣管內(nèi)灌注后7天組PMVECs共培養(yǎng)的Fbs群中，MFbs數(shù)量顯著增加，α-SMA蛋白的表達(dá)亦明顯上調(diào)；與BLM氣管內(nèi)灌注后7、14天組PMVECs共培養(yǎng)的Fbs中ColⅠA1的表達(dá)顯著上調(diào)。
　　5、抗體中和試驗(yàn)顯示，單獨(dú)使用TGF-β1抗體使共培養(yǎng)上清中TGF-β1的濃度下降

9、約53.15±8.91％，可使共培養(yǎng)的Fbs數(shù)量減少約23.39±2.12％，F(xiàn)bs群中MFbs百分比下降約4.68±0.86％（降幅約22.48％）；單獨(dú)使用CTGF抗體使共培養(yǎng)上清中CTGF的濃度下降約54.65±10.24％，可使共培養(yǎng)的Fbs數(shù)量減少約45.16±5.79％，F(xiàn)bs群中MFbs百分比下降約8.06±1.31％（降幅約38.71％）；而聯(lián)合使用TGF-β1和CTGF抗體使共培養(yǎng)上清中TGF-β1和CTGF濃度同比下

10、降約50％，可使共培養(yǎng)的Fbs數(shù)量減少約73.39±11.89％，F(xiàn)bs群中MFbs百分比下降約10.15±1.37％（降幅約48.75％）。
　　結(jié)論：
　　1、BLM誘導(dǎo)的大鼠PF過程中，PMVECs合成、分泌促纖維化細(xì)胞因子TGF-β1及CTGF的功能上調(diào)，尤其在病程早期，PMVECs合成、分泌細(xì)胞因子功能旺盛，細(xì)胞以分泌功能表型為主。
　　2、在體外共培養(yǎng)條件下，BLM大鼠PMVECs可促進(jìn)正常鼠Fbs的增殖、