重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ受體1反義基因預(yù)防高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓及防治并發(fā)癥作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腎素-血管緊張素Ⅱ-醛固酮系統(tǒng)(RAS)被公認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)心血管和腎臟功能的最重要體系之一。血管緊張素Ⅱ與血管緊張素Ⅱ受體1(AT1)結(jié)合后強(qiáng)烈收縮血管、促進(jìn)醛固酮分泌導(dǎo)致鈉水潴留，促使血壓升高。高鹽作為高血壓的一個(gè)重要的獨(dú)立病因一直廣受關(guān)注和爭(zhēng)議。目前的研究表明高鹽可以激活RAS系統(tǒng)，同時(shí)還可誘導(dǎo)血管緊張素Ⅱ受體1(AT1)的表達(dá)增加，這些均是導(dǎo)致血壓升高的原因。因此在本研究中我們利用重組雙鏈腺相關(guān)病毒(rAAV)為載體，將大鼠血管

2、緊張素Ⅱ受體1反義基因(反義AT1)導(dǎo)入長(zhǎng)期高鹽飲食的SD大鼠體內(nèi)，利用反義基因的作用減少AT1的表達(dá)，以研究反義AT1對(duì)高鹽誘導(dǎo)的高血壓和心血管系統(tǒng)及腎臟功能的影響。 重組雙鏈腺相關(guān)病毒載體(doublestrandedadeno-associatedvirusrAAV)是一種近年來被廣泛研究的基因載體，轉(zhuǎn)染后可獲得穩(wěn)定、長(zhǎng)期、高效的表達(dá)，能轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞；無免疫原性，轉(zhuǎn)染效率較高，而且它有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)——可以整合到生

3、物染色體的特定部位，解決了病毒載體安全性的問題；而且無需像傳統(tǒng)的單鏈系統(tǒng)那樣進(jìn)入體內(nèi)后還要再?gòu)?fù)制成雙鏈。新的雙鏈系統(tǒng)表達(dá)更快，效率更高。 為了實(shí)現(xiàn)目的基因在罹患高血壓動(dòng)物的體內(nèi)長(zhǎng)期、穩(wěn)定、安全的表達(dá)，從而達(dá)到長(zhǎng)期、穩(wěn)定降壓的目的，并觀察它對(duì)各種高血壓并發(fā)癥的預(yù)防作用，我們將大鼠反義AT1基因克隆入重組雙鏈腺相關(guān)病毒載體中，并包裝成病毒顆粒，經(jīng)過肝素柱純化獲得高滴度的rAAV-D(+)-AT1-AS病毒。然后分別經(jīng)尾靜脈分別注射r

4、AAV-D(+)-AT1--AS(實(shí)驗(yàn)組)和rAAV-D(+)-GFP(對(duì)照組)這兩種病毒顆粒(2×1010p.f.u/大鼠，每組6只)。2周后，以高鹽(8％氯化鈉)飼料喂養(yǎng)，注射前及注射后每2周監(jiān)測(cè)動(dòng)脈收縮壓，每2周收集24小時(shí)尿。同時(shí)觀察動(dòng)物行為變化，實(shí)驗(yàn)周期為12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管，用美國(guó)PowerLab公司的心功能測(cè)定儀測(cè)定大鼠心功能的各項(xiàng)指標(biāo)。最后處死動(dòng)物，并取心、主動(dòng)脈、腎等組織提取總RNA。用RT-PCR檢測(cè)A

5、T1mRNA的表達(dá)情況；檢測(cè)尿中Na+，K+及微量白蛋白的含量；主要臟器稱重并固定切片作形態(tài)學(xué)分析以觀察腎臟損傷情況和心血管重構(gòu)情況。采用放免法檢測(cè)血漿AngⅡ濃度。 結(jié)果：①高鹽飲食1周后，對(duì)照組大鼠血壓開始明顯升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)血壓達(dá)到(142.7±4.5mmHg)；實(shí)驗(yàn)組大鼠在前3周血壓也出現(xiàn)了輕度升高，3周后血壓一直穩(wěn)定在正常范圍，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)血壓維持在(117±3.8mmHg)。②經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管進(jìn)行血液動(dòng)力學(xué)測(cè)定顯示，基

6、因?qū)胧剐墓δ艿玫斤@著改善，實(shí)驗(yàn)組大鼠左室舒張末壓(LVEDP)、左室收縮壓峰值(LVPSP)及左室最大上升和下降速率(±dp/dtmax)值均較對(duì)照組有顯著性的差異；心率也明顯低于對(duì)照組。③半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組心臟、腎臟、血管的AT1基因的mRNA表達(dá)較對(duì)照組有顯著下降。④實(shí)驗(yàn)組尿微量白蛋白的含量和Na+/K+比值明顯低于對(duì)照組；腎臟天狼星紅染色結(jié)果顯示：對(duì)照組腎臟間質(zhì)纖維化，腎小球細(xì)動(dòng)脈管壁增厚，膠原沉積，呈現(xiàn)纖維化

7、表現(xiàn)；而實(shí)驗(yàn)組較為正常，未見明顯膠原沉積。這表明反義AT1基因可預(yù)防或明顯改善高鹽引起的腎功能損害。⑤心臟天狼星紅染色結(jié)果顯示：對(duì)照組心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，間質(zhì)增生而治療組結(jié)構(gòu)正常，心肌組織大量膠原沉積；而治療組結(jié)構(gòu)正常未見異常的膠原沉積；這說明反義AT1可以預(yù)防高血壓引起的心肌重構(gòu)；兩組動(dòng)物的心臟重量和體重比也從側(cè)面證實(shí)了這些結(jié)果。⑥AngⅡ放免法檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組和正常組血漿AngⅡ維持在正常水平，對(duì)照組血漿AngⅡ明顯降低，證

8、明反義AT1基因治療雖下調(diào)了AT1的表達(dá)，但并未增加血漿AngⅡ的含量。 結(jié)論：由我們的結(jié)果可以看出，重組雙鏈腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的大鼠反義AT1基因可以在動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)，在抑制動(dòng)物血壓升高的同時(shí)，還發(fā)揮了預(yù)防高血壓的各種并發(fā)癥(包括腎臟損害和心血管系統(tǒng)重構(gòu)等)的作用。而且實(shí)驗(yàn)過程中兩組動(dòng)物并未出現(xiàn)因?yàn)椴《据d體注入和表達(dá)所引起的嚴(yán)重毒副作用。所以我們認(rèn)為，重組雙鏈腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的反義AT1基因?yàn)橹委煾哐獕翰?、預(yù)防心血管