視神經(jīng)脊髓炎B細胞相關(guān)生物標(biāo)記物的探討及LPS對AQP4抗體致病性的影響.pdf

1、目的:
　　1.檢測視神經(jīng)脊髓炎(NMO)患者血清及腦脊液中 B淋巴細胞活化因子(BAFF)的水平,探討B(tài)AFF能否作為一種生物標(biāo)記物,以及在鑒別診斷及推測疾病活動性中所起的作用;
　　2.檢測NMO患者外周血中CD1d( hi) CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細胞的比例,探討調(diào)節(jié)性B細胞能否作為NMO和多發(fā)性硬化(MS)鑒別診斷的生物標(biāo)記物,并為發(fā)現(xiàn)二者存在不同的免疫機制提供更多理論依據(jù);
　　3.建立NMO模型,驗證水

2、通道蛋白4抗體(AQP4-Ab)的致病性,并為進一步研究提供平臺;
　　4.觀察脂多糖(LPS)預(yù)處理對AQP4-Ab致病性的影響,探討小膠質(zhì)細胞激活在NMO發(fā)病中的作用及可能的機制。
　　方法:
　　1.收集2012年4月至2013年10月間就診于解放軍總醫(yī)院門診及住院部的NMO和MS患者的臨床資料,所有患者均為急性復(fù)發(fā)期。其中NMO44例,MS38例。對照組血清標(biāo)本來自體檢中心健康正常人,共30例,腦脊液標(biāo)本來自同

3、期住院的非炎性神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者,共15例,采用ELISA法檢測腦脊液及血清中 BAFF的水平,流式細胞儀技術(shù)檢測外周血中 CD1d( hi) CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細胞的比例。
　　2.利用原代細胞培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)新生大鼠皮層細胞,AQP4-Ab陽性的NMO患者血清進行干預(yù),通過免疫熒光技術(shù)檢測培養(yǎng)細胞中MAP2、GFAP、CD11b的表達情況,以觀察神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞形態(tài)的改變,建立NMO模型。
　　3.在

4、模型的基礎(chǔ)上,給予LPS預(yù)處理,通過免疫熒光技術(shù)檢測培養(yǎng)細胞MAP2、GFAP、CD11b的表達變化情況,通過 ELISA法檢測培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ水平的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1. NMO組、MS組和對照組血清中BAFF水平分別為250.2±126.9pg/ml、249.6±130.7 pg/ml和222.9±126.1pg/ml,三組間兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NMO組、MS組和對照組腦

5、脊液中 BAFF水平分別為525.8±230.0pg/ml、298.4±141.9 pg/ml和141.4±76.2 pg/ml,三組兩兩比較, NMO組和MS組腦脊液中BAFF水平較對照組明顯增高,NMO組腦脊液中BAFF水平較MS組明顯增高(P<0.05)。且NMO組、MS組的腦脊液中BAFF水平與EDSS評分存在相關(guān)性,EDSS評分越高,其腦脊液中BAFF水平越高(r值分別為0.887和0.885)。但是,NMO組腦脊液中BAFF

6、水平與AQP4抗體滴度之間不具有相關(guān)性。
　　2. NMO組、MS組及對照組外周血CD1d( hi) CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細胞細胞占CD19+ B細胞的比例分別為(7.94±4.16)％、(20.61±11.13)%和(19.35±8.04)%,占淋巴細胞的比例分別為(1.61±0.89)%、(2.70±1.21)%和(2.52±1.27)%,三組比較,NMO組外周血CD1d( hi) CD5+CD19+細胞比例最低( P<

7、0.05), MS組與對照組比較無明顯變化(P>0.05)。AQP4-Ab+NMO組和 AQP4-Ab-NMO組 CD1d( hi) CD5+ CD19+細胞占CD19+B細胞的比例分別為(6.8%,1.33-14.2%)和(8.8%,3.5-20.0%),占淋巴細胞的比例分別為(1.43%,0.2-1.9%)和(2.60%,1.07-4.32%),兩組比較,AQP4-Ab+NMO組 CD1d( hi) CD5+ CD19+細胞比例明顯

8、偏低(P<0.05)。
　　3.原代培養(yǎng)新生大鼠皮層細胞,經(jīng)AQP4抗體陽性患者血清進行誘導(dǎo),星形膠質(zhì)細胞腫脹,神經(jīng)元固縮。小膠質(zhì)細胞胞體明顯增大,有偽足樣突起。與空白對照組和正常血清組比較,AQP4抗體陽性血清組 GFAP陽性細胞、CD11b陽性細胞中心聚焦區(qū)域面積明顯增大,MAP2陽性細胞中心聚集區(qū)域面積明顯減小,GFAP、CD11b陽性細胞周圍投射長度明顯增長,MAP2陽性細胞周圍投射長度明顯縮短(P<0.05)。
　

9、　4. LPS預(yù)處理后, AQP4抗體陽性血清對星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的損傷進一步加重,星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元發(fā)生凋亡。與單純AQP4-Ab陽性血清組比較,LPS預(yù)處理+AQP4-Ab陽性血清組MAP2、GFAP免疫熒光陽性中心聚集區(qū)域面積明顯縮小,MAP2免疫熒光陽性周圍投射區(qū)域長度明顯縮短,GFAP免疫熒光陽性周圍投射區(qū)域無法測量, CD11b周圍投射區(qū)域長度明顯增加(P<0.05)。CD11b免疫熒光陽性中心聚集區(qū)域面積無明顯變化(P

10、>0.05)。脂多糖預(yù)處理6h后,培養(yǎng)上清液中TNF-α水平明顯升高,而IFN-γ的水平未發(fā)生明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1.腦脊液中BAFF水平可作為NMO和MS鑒別診斷的生物標(biāo)記物,并在判定疾病活動性中具有一定價值。
　　2.外周血中CD1d( hi) CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細胞可作為NMO和MS鑒別診斷的生物標(biāo)記物,并提示NMO與MS,AQP4-Ab+NMO與AQP4-Ab-NMO的免疫機制不同。