跨膜區(qū)突變對ABC轉運蛋白Pdr5p功能的影響及其機制研究.pdf

1、真菌感染在臨床上能導致高致死率，在艾滋病病人和接受器官移植或者進行化療的免疫缺陷群體中更為明顯。抗真菌藥物的長期使用可能導致藥物耐受和治療失敗。以致病微生物為對象研究藥物抗性產生的機制對于解決日益嚴重的耐藥問題非常重要。
　　 致病釀酒酵母菌株YJM789具有許多與致病性相關的表型。在本研究中，我們使用通過全基因組鋪瓦芯片進行基因分型的四分體分離子庫對導致釀酒酵母BY4741(實驗室菌株)與YJM789菌株氟康唑抗性差異的基因進

2、行遺傳定位，結果顯示YJM789中PDR5基因序列的巨大變異是導致其對氟康唑高度敏感的關鍵因素。
　　 PDR5基因編碼一個外排泵，它通過外排大量結構差異很大的毒性化合物賦予細胞多藥物抗性。我們使用GFP分別標記了BY4741與YJM789中的PDR5，熒光顯微鏡觀察表明YJM789中Pdr5p-GFP融合蛋白定位于細胞膜，且過表達YJM789 PDR5無法回補BY4741 pdr5缺失株的抗藥表型。這些結果說明在YJM789中

3、由Pdr5p所介導的唑類藥物抗性下降不是由于Pdr5p錯誤定位或表達下調而是由Pdr5p功能受損所引起。
　　 我們在藥物瓊脂平板及液體培養(yǎng)液中比較了YJM789與BY4741對唑類及多烯類抗真菌藥物的抗性，結果表明雖然YJM789中PDR5突變導致其對氟康唑外排能力嚴重受損，但同樣的突變卻賦予細胞在多烯抗生素下生長的優(yōu)勢。
　　 為研究序列變異對YJM789 Pdr5p功能的影響，我們通過片段替換的方法將劃分的BY47

4、41 PDR5片段替換為YJM789 PDR5的相應片段，構建了一序列PDR5嵌合表達載體。通過使用氟康唑與放線菌酮抗性實驗評估各Pdr5p嵌合體的外排功能，同時研究其表達、亞細胞定位、ATPase活性以及羅丹明6G外排效率等特性，結果顯示位于預測的連接第十與第十一跨膜螺旋胞內環(huán)內1352位點由丙氨酸到甲硫氨酸的突變可導致Pdr5p藥物外排能力嚴重下降，且其影響程度與突變殘基的大小相關。我們的研究為解釋ABC轉運蛋白的功能機制、研制更為