跨膜區(qū)突變對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pdr5p功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、真菌感染在臨床上能導(dǎo)致高致死率，在艾滋病病人和接受器官移植或者進(jìn)行化療的免疫缺陷群體中更為明顯。抗真菌藥物的長期使用可能導(dǎo)致藥物耐受和治療失敗。以致病微生物為對(duì)象研究藥物抗性產(chǎn)生的機(jī)制對(duì)于解決日益嚴(yán)重的耐藥問題非常重要。
　　 致病釀酒酵母菌株YJM789具有許多與致病性相關(guān)的表型。在本研究中，我們使用通過全基因組鋪瓦芯片進(jìn)行基因分型的四分體分離子庫對(duì)導(dǎo)致釀酒酵母BY4741(實(shí)驗(yàn)室菌株)與YJM789菌株氟康唑抗性差異的基因進(jìn)

2、行遺傳定位，結(jié)果顯示YJM789中PDR5基因序列的巨大變異是導(dǎo)致其對(duì)氟康唑高度敏感的關(guān)鍵因素。
　　 PDR5基因編碼一個(gè)外排泵，它通過外排大量結(jié)構(gòu)差異很大的毒性化合物賦予細(xì)胞多藥物抗性。我們使用GFP分別標(biāo)記了BY4741與YJM789中的PDR5，熒光顯微鏡觀察表明YJM789中Pdr5p-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞膜，且過表達(dá)YJM789 PDR5無法回補(bǔ)BY4741 pdr5缺失株的抗藥表型。這些結(jié)果說明在YJM789中

3、由Pdr5p所介導(dǎo)的唑類藥物抗性下降不是由于Pdr5p錯(cuò)誤定位或表達(dá)下調(diào)而是由Pdr5p功能受損所引起。
　　 我們?cè)谒幬锃傊桨寮耙后w培養(yǎng)液中比較了YJM789與BY4741對(duì)唑類及多烯類抗真菌藥物的抗性，結(jié)果表明雖然YJM789中PDR5突變導(dǎo)致其對(duì)氟康唑外排能力嚴(yán)重受損，但同樣的突變卻賦予細(xì)胞在多烯抗生素下生長的優(yōu)勢(shì)。
　　 為研究序列變異對(duì)YJM789 Pdr5p功能的影響，我們通過片段替換的方法將劃分的BY47

4、41 PDR5片段替換為YJM789 PDR5的相應(yīng)片段，構(gòu)建了一序列PDR5嵌合表達(dá)載體。通過使用氟康唑與放線菌酮抗性實(shí)驗(yàn)評(píng)估各Pdr5p嵌合體的外排功能，同時(shí)研究其表達(dá)、亞細(xì)胞定位、ATPase活性以及羅丹明6G外排效率等特性，結(jié)果顯示位于預(yù)測(cè)的連接第十與第十一跨膜螺旋胞內(nèi)環(huán)內(nèi)1352位點(diǎn)由丙氨酸到甲硫氨酸的突變可導(dǎo)致Pdr5p藥物外排能力嚴(yán)重下降，且其影響程度與突變殘基的大小相關(guān)。我們的研究為解釋ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能機(jī)制、研制更為