Rv1984c和ESAT-6的原核表達及其和其他抗原組合在結核病血清診斷中的應用研究.pdf

1、結核病(tuberculosis，TB)是目前傳染病的頭號殺手。我國在全球22個TB高負擔國家中居2位。目前常用的結核病診斷方法，主要依靠痰涂片、細菌培養(yǎng)、結核菌素(PPD)等檢測技術，耗時長，敏感度和特異性低，常常導致漏診和誤診，從而延誤了和治療時機，也給病人帶來巨大的經(jīng)濟負擔。因此，建立快速，敏感，簡便的早期診斷方法是目前國內(nèi)外檢測結核病繼續(xù)解決的問題。因此尋找到結核分支桿菌的特異性抗原，對于結核病的診斷具有重要意義免疫診斷作為其防

2、控的早期診斷技術之一，近年來得到更加廣泛的關注。而結核分枝桿菌RD區(qū)編碼蛋白的發(fā)現(xiàn)，促進了結核病免疫診斷的迅速發(fā)展。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)簡單、快速、易于操作、又不需特殊精密儀器，由于該檢測方法具有被廣泛應用于臨床檢驗以及科學研究中。將酶的高效催化作用和抗原或抗體的免疫方法結合起來，對抗原抗體反應級聯(lián)放大，再經(jīng)酶分解底物顯色，敏感地檢測血清中微量的特異性抗原或抗體。將優(yōu)勢抗原和酶聯(lián)免疫吸附實驗結合起來，建立起快速、簡便、準確的血

3、清學免疫診斷法受到越來越多的關注。
　　 本文選取RD區(qū)編碼的基因esat-6和Rv1984，利用PCR從結核分枝桿菌標準株H37RV株擴增出目的片段，并將其分別克隆到表達載體pET30a和pET28a中，構建重組表達質粒并轉化到E.coil BL21(DE3)表達菌株，經(jīng)IPTG誘導表達后，用SDS-PAGE進行分析，選最佳的表達條件和可溶性分析。用純化后的Rv1984c、ESAT-6和ESAT-6-CFP-10-16KD重組

4、蛋白做為包被抗原，對結核病人進行血清免疫學檢測。探討單個抗原和混合抗原對結核病診斷的敏感性和特異性，為進一步結核病診斷試劑盒的研發(fā)提供依據(jù)。結果表明：⑴用PCR方法從結核分枝桿菌H37Rv國際標準株中擴增出目的基因Rv1984c和esat-6基因大小與目的基因大小一樣，分別為576bp和288bp；構建的重組質粒經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定，經(jīng)NCBI比對后，符合率都達到100％；⑵重組工程菌pET28a-Rv1984c和pET30a-ES

5、AT-6，分子量分別為23KD和17.1KD。pET28a-Rv1984c在25℃，終濃度為1mM IPTG誘導6h時表達量最多；pET30a-ESAT-6在25℃，終濃度為1mM IPTG誘導4h時表達量最多，之后隨著誘導時間的增加，表達量逐漸下降。⑶重組工程菌pET28a-Rv1984c超聲破碎后，經(jīng)SDS-PAGE分析為包涵體表達，經(jīng)半透膜透析復性后為可溶性表達；重組工程菌pET30a-esat-6超聲破碎后，經(jīng)SDS-PAGE分

6、析為可溶性表達；⑷pET28a-Rv1984c和pET30a-esat-6經(jīng)Ni-NTA親和純化后分別獲得純度為97.4％和51.2％的重組蛋白；⑸重組蛋白pET28a-Rv1984c和pET30a-ESAT-6、ESAT-6-CFP-10-16KD為包被抗原建立間接ELISA法，結核病患者、非結核呼吸系統(tǒng)疾病患者和健康人群血清。結果顯示，靈敏度分別為46.8％，70.21％和88.37％，特異性分別為76.71％，90.4％和97.4