苦豆子多糖的分離提純和組分分析及其化學(xué)修.pdf

1、苦豆子是豆科槐屬植物苦豆子的干燥全草、根及種子，其本身具有清熱解毒，殺蟲止癢等功效。近幾年科學(xué)研究證實因其具有很好的抗癌、抗氧化、抗心律失常、增強(qiáng)機(jī)體免疫等藥理作用[1]而越來越受到醫(yī)藥界人士的關(guān)注。苦豆子多糖作為從苦豆子藥材中提取的一類特殊的生物高分子物質(zhì)很少被廣泛的應(yīng)用和報道。本課題組經(jīng)初步實驗研究顯示苦豆子多糖具有一定的抗腫瘤效果。為了證實苦豆子多糖是如何發(fā)揮抗腫瘤作用，并進(jìn)一步開發(fā)其他藥理活性，本論文將從苦豆子多糖的提取分離純化

2、為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探究其分子結(jié)構(gòu)，并通過一系列的結(jié)構(gòu)修飾研究其體外抗氧化活性，為今后苦豆子多糖的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供合理的理論依據(jù)。本課題主要從苦豆子多糖的分離提純、組分分析、化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾以及苦豆子多糖及其衍生物的體外抗氧化活性這幾個方面進(jìn)行研究。
　　第一部分苦豆子多糖的分離純化和組分分析
　　苦豆子藥材經(jīng)過水提醇沉法得到粗多糖，再依次經(jīng)過Sevage法脫蛋白，20萬截留分子量的中空纖維膜微濾，DEAE-Sephadex

3、A-25陰離子交換柱層析和凝膠 G-200柱層析進(jìn)行分級純化。通過以上分離純化步驟，最終得到四種相對分子質(zhì)量分布均一的純多糖，分別命名為 SAP-S I，SAP-S II，SAP-S III和SAP-S IV，其中最大組分SAP-S I經(jīng)G-200柱層析檢測其為均一多糖(SAP)，多糖含量高達(dá)98.85％。TFA完全水解后的多糖通過高效薄層色譜法測得單糖組成，得到四種單糖成分，分別為甘露糖、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖；利用PMP柱前衍生化H

4、PLC法最終得到四種單糖摩爾比為：D-甘露糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-鼠李糖=370:190:10:1；
　　第二部分苦豆子多糖的理化性質(zhì)和分子量的測定
　　采用苯酚-硫酸法測定各糖組分中總糖、蛋白質(zhì)和葡萄糖醛酸含量,繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計算出各組分含量。其中SAP總糖含量為98.85%，SAP-SII總糖含量為95.58%。采用高效凝膠色譜法對苦豆子多糖的分子量進(jìn)行測定，最終得出苦豆子多糖(SAP)分子量為

5、9.6×105左右；
　　第三部分苦豆子多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾
　　以苦豆子多糖為原料，采用氫氧化鈉—氯乙酸鈉反應(yīng)體系，對苦豆子多糖進(jìn)行羧甲基化修飾。以羧甲基取代度為指標(biāo)，通過L9(34)正交試驗確定了其最優(yōu)反應(yīng)條件：原料苦豆子多糖50mg，在氯乙酸鈉0.5g，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間5h，氫氧化鈉濃度25%的優(yōu)化條件下，羧甲基苦豆子多糖取代度DS可達(dá)1.50以上。且紅外光譜分析表明，該方法已成功引入了羧甲基基團(tuán)；以苦豆子多糖為

6、原料，甲酰胺為溶劑，乙酸酐為乙?；噭喽棺佣嗵沁M(jìn)行乙酰化修飾，得到修飾后的乙?；喽棺佣嗵牵ㄟ^紅外光譜特征分析表明，該方法很好的實現(xiàn)了苦豆子多糖的乙?；揎棥?br>　　第四部分苦豆子多糖及其衍生物的抗氧化活性研究
　　通過體外抗氧化實驗和還原性實驗，以VC為陽性對照，研究苦豆子多糖、羧甲基化苦豆子多糖和乙酰化苦豆子多糖的抗氧化活性和還原能力。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，三種多糖對1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·

7、)、羥基自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)都有很好的清除作用，還原能力也有所提高，且清除率隨著多糖濃度增加而逐漸增大。其中，四者清除1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)和羥基自由基(·OH)的能力大小均為 VC>羧甲基化苦豆子多糖>乙酰化苦豆子多糖>苦豆子多糖；清除超氧陰離子自由基(O2-·)的能力大小依次為 VC>乙酰化苦豆子多糖>羧甲基化苦豆子多糖>苦豆子多糖；還原能力大小依次為VC>乙?；喽棺佣嗵?羧甲基化