抵抗素與糖尿病大血管并發(fā)癥的關(guān)系及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:糖尿病大血管并發(fā)癥，即加速發(fā)生發(fā)展的動(dòng)脈粥樣硬化，是糖尿病病人致殘、致死的首要原因。目前認(rèn)為，在糖尿病以及糖尿病前期，多種因素加速了動(dòng)脈粥樣硬化病變的進(jìn)展。抵抗素(resistin )是存在于血漿中的富含半膚氨酸的分泌性蛋白。與嚙齒類(lèi)動(dòng)物脂肪細(xì)胞特異性分泌抵抗素不同，人體內(nèi)抵抗素主要在外周血單核細(xì)胞中表達(dá)。初步研究提示:抵抗素可能在炎癥反應(yīng)以及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。本課題通過(guò)測(cè)定冠狀動(dòng)脈造影患者血清抵抗素水平

2、，探討抵抗素與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系及其可能在糖尿病大血管并發(fā)癥中所起的作用;體外實(shí)驗(yàn)首先探討抵抗素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中纖溶酶原激活物抑制物-1 (PAI-1)表達(dá)的影響及其分子機(jī)制，以探討抵抗素在斑塊發(fā)展及并發(fā)癥發(fā)生中所起的作用;同時(shí)，觀察氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL )作用于巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞中抵抗素表達(dá)水平的改變;應(yīng)用抵抗素蛋白作用于巨噬細(xì)胞，觀察細(xì)胞吞噬脂質(zhì)的情況以及清道夫受體表達(dá)水平的變化，以探討抵抗素在巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化

3、過(guò)程中的作用，從而多方面地研究抵抗素在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的作用。 材料與方法:在自04年9月至OS年3月住院行冠狀動(dòng)脈造影的患者中隨機(jī)選取88例，分為單純冠心病組、糖尿病合并冠心病組、單純糖尿病組以及正常對(duì)照組。受試者血清行生化檢查及抵抗素、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、可溶性腫瘤壞死因子受體2(sTNF-R2)的測(cè)定。在建立了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUvECs)原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用熒光定量PCR、Northem blot

4、以及Western blot檢測(cè)技術(shù)研究抵抗素對(duì)HUV：ECs：PAI-lmRNA及蛋白表達(dá)的影響；采用熒光探針DCFH-DA(二氯熒光黃乙二脂)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)水平；凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA，E1ectrophoreticMobilitV Shift Assay)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-KB的激活；應(yīng)用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)以及NF-KB的特異性抑制劑emodin檢測(cè)抵抗素、氧化應(yīng)激以及NF-KB激活與PAI-

5、l表達(dá)水平的關(guān)系。在建立了人外周血單核細(xì)胞分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用熒光定量PCR觀測(cè)ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞抵抗素mRNA表達(dá)的影響；用尼羅紅染色法觀察抵抗素對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)含量的改變；熒光定量PCR觀測(cè)清道夫受體SRA與CD36 mRNA表達(dá)的變化；Western blot以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：1)冠心病、糖尿病合并冠心病以及糖尿病患者血清抵抗素以及hs-CRP、sTNF-R2水平均高于對(duì)照組(P<0.

6、05)；抵抗素與sTNF-R2水平之間呈正相關(guān)(r=0.24，P=0.025)；冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)(b=0.1 55，P=0.001)是影響血清抵抗素水平的因素；隨著冠脈病變支數(shù)的增加，血清抵抗素水平呈增高的趨勢(shì)(P=0.004)。2)抵抗素時(shí)間、劑量依賴性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PAI-1；抵抗素使細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，后者激活NF-KB后促進(jìn)PAI-1表達(dá)；10mM NAC或5μg／ml emodin均顯著抑制抵抗素促使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PAI-1

7、的作用。3)50μg／ml蛋白的ox-LDL呈時(shí)間依賴性增加巨噬細(xì)胞中抵抗素mRNA表達(dá)水平；100ng／m1抵抗素可使巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)熒光染色強(qiáng)度顯著增加；抵抗素時(shí)間、劑量依賴性提高CD36的mRNA及其蛋白的表達(dá)水平，而對(duì)SRA表達(dá)水平無(wú)顯著影響。 結(jié)論：冠心病患者血清抵抗素水平增高；過(guò)高的抵抗素水平可引起內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激并通過(guò)NF-KB信號(hào)途徑促進(jìn)PAI-1表達(dá)，導(dǎo)致纖溶活性異常；OX-LDL可促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)抵抗素；過(guò)多