BTLA蛋白胞外區(qū)片段及其Mab的制備、鑒定.pdf

1、機(jī)體的免疫應(yīng)答是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，有許多免疫細(xì)胞和免疫分子(膜分子和可溶性分子)參與并受到嚴(yán)格的調(diào)控。B7-CD28家族共刺激信號(hào)分子在T淋巴細(xì)胞激活、抑制機(jī)體耐受及產(chǎn)生T細(xì)胞免疫應(yīng)答等方面起著關(guān)鍵的作用。 最近，繼CTLA-4和PD-1之后，Watanabe等鑒定出來(lái)了一個(gè)新的抑制性Ig超家族受體-BTLA(BandTlymphocyteattenuator)及其配體B7x(B7-H4)，后者是B7超家族的一個(gè)新成員。雖然B

2、TLA和其它B7家族成員的受體只有相對(duì)較低的序列同源性(9％～13％)，但是其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似于CTLA-4和PD-1。BTLA是I型跨膜糖蛋白，有一個(gè)胞外單IgV-樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)胞漿區(qū)，而一個(gè)單IgV-樣結(jié)構(gòu)域是B7家族成員的所有受體的共同特征。此外，BTLA胞漿區(qū)含3個(gè)酪氨酸殘基，它們分別包含于以下序列基序中：一個(gè)Grb2潛在結(jié)合位點(diǎn)，兩個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和一個(gè)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)。這些基序

3、在鼠和人中是保守的，是和PD-1一樣的共同特征。ITIM存在于許多抑制性受體中，可結(jié)合和激活酪氨酸磷酸酶，后者使已發(fā)生磷酸化的酪氨酸脫磷酸化，從而抑制蛋白酪氨酸激酶(PTK)依賴(lài)的細(xì)胞活化，在免疫負(fù)調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。ITIM序列的存在提示BTLA可以作為一個(gè)抑制性受體起作用。T細(xì)胞分化以后，只有Th1細(xì)胞表達(dá)BTLA，并且其表達(dá)不依賴(lài)于IL-12或IFN-γ信號(hào)，這提示在Th1細(xì)胞中BTLA可能有一個(gè)明確的作用。同時(shí)，BTLA轉(zhuǎn)錄本

4、也可在B細(xì)胞和B細(xì)胞系中檢測(cè)得到，提示該受體也可以在調(diào)節(jié)B細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮作用。在體外，極化了的BTLA缺陷的Th1細(xì)胞顯示出比野生型Th1細(xì)胞更高的增殖反應(yīng)。NP-KLH免疫BTLA缺陷鼠導(dǎo)致了針對(duì)NP-KLH特異的IgG1、IgG2a和IgG2b抗體的水平升高了3倍。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)模型中，BTLA缺陷型小鼠的發(fā)病率和嚴(yán)重程度都升高。用抗-B7x封閉抗體進(jìn)行處理會(huì)加重EAE，而輸注B7x-Ig則抑制T細(xì)胞增殖。而

5、且，B7x-Ig的處理會(huì)抑制CD8+CTL成熟與增殖，并在一個(gè)移植物抗宿主疾病(GVHD)模型中延長(zhǎng)存活時(shí)間。調(diào)控抑制性受體—配體之間的的信號(hào)傳導(dǎo)，有利于腫瘤的排斥和腫瘤細(xì)胞的殺傷，誘導(dǎo)T細(xì)胞特異性免疫耐受的產(chǎn)生，有助于自身免疫性疾病或超敏反應(yīng)及異體移植排斥的防治。類(lèi)似CTLA-4和PD-1，BTLA對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的負(fù)性調(diào)節(jié)以及在維持外周耐受中可能起到同樣的作用。 基于以上分析，我們可以參照以前對(duì)CTLA-4和PD-1及其相應(yīng)配體

6、的研究，通過(guò)自行制備的BTLA胞外區(qū)的單克隆抗體來(lái)阻斷BTLA與B7x之間的相互作用，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，本研究擬克隆并表達(dá)exBTLA，建立穩(wěn)定表達(dá)exBTLA的Flp-InCHO細(xì)胞系，用ProteinG-Sepharose4BFastFlow親和層析柱從重組細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化exBTLA-IgG4Fc融合蛋白，制備并鑒定BTLA的單克隆抗體，作為進(jìn)一步研究抑制性信號(hào)傳導(dǎo)的工具。 本文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果包括：1.用

7、DNAstar2.0軟件，根據(jù)BTLA基因的胞外區(qū)序列，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出exBTLA序列，以哺乳細(xì)胞高效表達(dá)質(zhì)粒載體pSec/WG為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒exBTLA/pSec/WG。經(jīng)雙酶切鑒定后，重組質(zhì)粒送上海申友生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向步移法測(cè)序鑒定了其正確性。 2.采用Lipofectamine2000試劑轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒到真核表達(dá)細(xì)胞系Flp-InCHO中，并在含潮霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和篩選，得到相應(yīng)的表達(dá)重組基

8、因的細(xì)胞克隆。 3.將轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的Flp-InCHO細(xì)胞在UltraCHO無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集上清，再用ProteinG-Sepharose4BFastFlow親和層析柱對(duì)exBTLA-IgG4Fc融合蛋白進(jìn)行親和純化。SDS-PAGE鑒定其純度后，再用Western-blot方法檢測(cè)表達(dá)蛋白的分子量，結(jié)果顯示其分子量和理論值一致。蛋白樣品濃縮后，用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。最后得到了高濃度、高純度的exBTLA-IgG4

9、Fc融合蛋白。 4.以exBTLA-IgG4Fc作為抗原免疫Balb/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，制備抗exBTLA的單克隆抗體(Mab)，得到3株均為IgGlKappa型Mab(2D10，1C3和1A6)。將生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞接種到預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔中制備腹水型抗人的exBTLAMab。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)證明腹水效價(jià)可達(dá)為1：105～1:106；Mab親和力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三株單克隆抗體的親和力依次為2D10

10、＞1A6＞1C3；Westernblot結(jié)果鑒定提示該Mab可以特異性的結(jié)合exBTLA，其分子量約為52×103。 綜上所述，我們應(yīng)用重組DNA技術(shù)與真核表達(dá)方法，獲得了具有exBTLA-IgG4Fc融合蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了純化，制備了其單克隆抗體。為我們進(jìn)一步探討B(tài)TLA在免疫自穩(wěn)調(diào)節(jié)中的地位、對(duì)初始型和活化的淋巴細(xì)胞上抑制性受體的表達(dá)水平控制因素特點(diǎn)的研究、精確的識(shí)別抑制性受體在細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)、評(píng)估基因編碼的抑制性受體基因多態(tài)