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文檔簡(jiǎn)介
1、彎曲菌是繼沙門(mén)菌、志賀菌之后影響動(dòng)物源性食品安全的又一個(gè)重要的人獸共患病原菌,不僅可導(dǎo)致人類胃腸炎和食物中毒,而且是人類格林-巴利綜合征的重要前驅(qū)因子。該菌廣泛存在于家禽腸道,尤其以雞腸道定植最甚,并通過(guò)污染雞肉導(dǎo)致人類感染。
充分認(rèn)知彎曲菌對(duì)動(dòng)物源性食品安全的影響,并及時(shí)采取科學(xué)的控制措施,是防止該彎曲菌危害人類健康的關(guān)鍵途徑。歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家擁有相對(duì)完善的致病菌定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系,包括彎曲菌對(duì)零售雞肉的污染狀況,大量研究數(shù)據(jù)可
2、以增強(qiáng)對(duì)彎曲菌病爆發(fā)的預(yù)警能力。而發(fā)展中國(guó)家包括中國(guó)的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)則相對(duì)匱乏,這一現(xiàn)狀嚴(yán)重制約了家禽生產(chǎn)及處理階段的防控措施的發(fā)展。
本研究對(duì)揚(yáng)州市區(qū)零售雞肉中的彎曲菌進(jìn)行了為期一年的定量流行病學(xué)研究,并運(yùn)用Box-Behnken Design的設(shè)計(jì)開(kāi)展三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn),優(yōu)化有機(jī)酸對(duì)雞肉表面彎曲菌的抑制條件,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了空腸彎曲菌的flgS突變株,比較突變株與野生株之間的酸耐受能力差異,為研究空腸彎曲菌的酸耐受
3、機(jī)制及其調(diào)控因子提供試驗(yàn)數(shù)據(jù),為建立雞肉中彎曲菌的高效減菌技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。
一、零售雞肉中彎曲菌的定量流行病學(xué)研究
2012年至2013年間,選取江蘇省揚(yáng)州市區(qū)3個(gè)超市和3個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),每月采集20份樣品,使用平板計(jì)數(shù)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定的方法,分別對(duì)其零售整雞中的彎曲菌進(jìn)行檢測(cè),并定量分析彎曲菌污染水平,連續(xù)監(jiān)測(cè)12個(gè)月。
檢測(cè)結(jié)果表明,240份整雞樣品的彎曲菌陽(yáng)性率為51.3%,陽(yáng)性樣品的平均帶菌量為14
4、73.49 CFU/g。123份陽(yáng)性樣品中,78.86%的樣品帶菌量超過(guò)20CFU/g。其中,超市樣品的陽(yáng)性率為35.8%,陽(yáng)性樣品的平均帶菌量為152.3CFU/g;農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)樣品的陽(yáng)性率為66.7%,陽(yáng)性樣品的平均帶菌量為2183.6CFU/g,農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)零售整雞樣品的彎曲菌污染情況明顯更為嚴(yán)重。兩種銷售方式下,整雞中彎曲菌污染水平隨季節(jié)變化的趨勢(shì)均很明顯,隨著夏季氣溫升高,樣品的陽(yáng)性率及陽(yáng)性樣品的平均帶菌量均穩(wěn)步上升,而冬季則大幅下降
5、。空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的分離率最高,分別為45.5%和30.9%。定性及定量結(jié)果顯示,揚(yáng)州市區(qū)的零售整雞中彎曲菌污染比較嚴(yán)重,控制零售環(huán)節(jié)中的整雞彎曲菌帶菌量迫在眉睫。
二、有機(jī)酸對(duì)雞肉表面彎曲菌的抑制方法建立及應(yīng)用
從《GB2760-2011食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》允許添加的有機(jī)酸中篩選出對(duì)彎曲菌抑菌性最強(qiáng)的乳酸。運(yùn)用控制變量法,根據(jù)乳酸對(duì)空腸彎曲菌NCTC11168菌株的抑制率,對(duì)影響乳酸抑菌效果的
6、3個(gè)單因素(濃度、時(shí)間、溫度)分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn),獲得3個(gè)單因素的最佳抑菌區(qū)間。根據(jù)Box-Behnken Design的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以濃度、時(shí)間和溫度3個(gè)因素為自變量,以抑菌率和肌苷酸含量作為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面分析法在三因素三水平上對(duì)處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化,以獲得最大抑菌率和肌苷酸含量。建立了低濃度長(zhǎng)時(shí)間處理模式及高濃度短時(shí)間處理模式,對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證,并將其應(yīng)用于肉雞屠宰加工生產(chǎn)線。
結(jié)果表明,根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果和回歸方程,利用軟件
7、獲得了低濃度長(zhǎng)時(shí)間處理模式的最佳組合條件,即乳酸濃度0.19%,處理時(shí)間17min,處理溫度20.9℃。在該條件下,抑菌率的預(yù)測(cè)值為98.62%,肌苷酸含量的預(yù)測(cè)值為1.8678mg/g。高濃度短時(shí)間處理模式的最佳組合條件為乳酸濃度0.82%,處理時(shí)間6.86s,處理溫度7.97℃。在該條件下,抑菌率的預(yù)測(cè)值為98.81%,肌苷酸含量的預(yù)測(cè)值為1.8775mg/g。雞肉模擬驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與理論預(yù)測(cè)值的誤差在±1%以內(nèi),說(shuō)明實(shí)驗(yàn)條件的參數(shù)準(zhǔn)確可
8、靠,按照建立的模型在實(shí)踐中進(jìn)行預(yù)測(cè)是可行的。將其應(yīng)用于屠宰生產(chǎn)線上后,不會(huì)顯著降低雞肉中彎曲菌的陽(yáng)性率,與傳統(tǒng)次氯酸鈉消毒的效果沒(méi)有顯著差異。單獨(dú)使用本研究建立的兩種抑菌模式對(duì)雞肉進(jìn)行處理,彎曲菌載量以及菌落總數(shù)之間沒(méi)有顯著差異,降低細(xì)菌載量的效果不及傳統(tǒng)方法,但是二者結(jié)合的減菌效果則與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。
三、空腸彎曲菌flgS突變株的構(gòu)建及其在酸耐受中的作用分析
根據(jù)GenBank上的空腸彎曲菌NCTC11168
9、全基因組序列,以及質(zhì)粒pRY107圖譜設(shè)計(jì)引物,應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增flgS基因以及卡那霉素抗性基因盒;將目的基因連接于克隆載體pMD-19T,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒,酶切鑒定;測(cè)序正確后,通過(guò)酶切連接反應(yīng)將載體中的卡那霉素抗性基因盒插入flgS基因內(nèi)部構(gòu)建自殺載體pMD19T-flgS-kanr;將自殺載體電轉(zhuǎn)化NCTC11168感受態(tài)細(xì)胞,同源重組篩選flgS突變株。
分別對(duì)野生株和突變株的酸耐受能力進(jìn)行了研究,在低濃度長(zhǎng)
10、時(shí)間酸脅迫和高濃度短時(shí)間酸脅迫中,突變株的抵抗力都明顯低于野生株,而二者在中性生長(zhǎng)環(huán)境中的生長(zhǎng)情況無(wú)明顯差異,表明flgS基因在空腸彎曲菌的酸耐受中扮演著非常重要的作用。鑒于flgS基因?yàn)檎{(diào)控基因,本研究應(yīng)用熒光定量PCR方法對(duì)該基因在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)其他脅迫相關(guān)基因的調(diào)控作用進(jìn)行了研究。flgS基因失活后,在酸環(huán)境中,大部分脅迫相關(guān)基因都會(huì)出現(xiàn)上調(diào),表明flgS基因失活會(huì)對(duì)其他脅迫基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)造成影響。且flgS在不同酸應(yīng)激中對(duì)其他脅迫基因
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