rhIL-24對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)外抗腫瘤效應(yīng)及其分子機(jī)理的研究.pdf

1、本文研究目的：為研究以hlL-24基因構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-21a(+)／hlL-24在大腸桿菌中表達(dá)及其部分純化、復(fù)性得到的蛋白產(chǎn)物——重組人白介素24(rhTT．-24)對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)外的抗腫瘤效應(yīng)及其分子機(jī)理。 研究方法：以原核表達(dá)載體pBV220-hlL-24為模板構(gòu)建新的pET-21a(+)／h11．-24重組原核表達(dá)載體系統(tǒng)，并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物純化、復(fù)性后得到初步純化的rhlL-2

2、4，經(jīng)Western-blot方法鑒定后，用rhlL-24刺激PBMC，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用ELISA方法檢測PBMC分泌的IL-6、IFN-~、TN~-／1的含量。用rhIL-24作用于體外培養(yǎng)的人A375黑色素瘤細(xì)胞，用MTT法去評(píng)價(jià)rhll．-24對(duì)A375細(xì)胞生長的影響，繪制出細(xì)胞生長曲線；通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，熒光染色等檢測rhlL-24對(duì)A375細(xì)胞生長周期和凋亡的影響。用rtffL-24作用于雞胚尿囊膜(CAM)，觀

3、察其對(duì)血管新生的影響。在裸鼠真皮下建立人A375細(xì)胞黑色素瘤動(dòng)物模型后，用rhlL-24治療，測量瘤體的體積及重量以檢測rhlL-24等對(duì)瘤體生長的抑制作用。用免疫組化檢測腫瘤組織中的BAX、BCL-2、CD34及VEGF的表達(dá)情況，以確認(rèn)經(jīng)rhlL-24治療后腫瘤細(xì)胞生長是否受到抑制及腫瘤組織血管新生是否減少。 研究結(jié)果：經(jīng)PCP-,及酶切產(chǎn)物電泳證實(shí)所克隆的基因長度與理論值接近，經(jīng)序列測定證實(shí)所克隆的基因與GenBank報(bào)道

4、的hIL-24序列完全一致，為474bp。構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-21a(+)／hIL-24，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，原核表達(dá)載體：陶建正確。pET-21a(+)／hIL-24轉(zhuǎn)染的BL21宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)后裂解菌體、提取包涵體的內(nèi)容物，再進(jìn)行SDS-PAGE電泳，有一條18．5KD左右的蛋白條帶出現(xiàn)，與理論值一致。Western-blot檢測該產(chǎn)物能與IL-24抗體形成特異性條帶。含pET-21a(+)／hIL-24的宿主菌BL21經(jīng)異

5、丙基．B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后，rhIL-24在大腸桿菌中獲高效表達(dá)。初步純化的rhlL-24能刺激PBMC增加IL-6、IFN-γ／及TNF-α的分泌，72h分泌達(dá)到高峰，與陰性對(duì)照組相比，具有顯著差異(P<0．01)。rhIL-24能顯著抑制A375細(xì)胞的生長，抑制作用具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性；rhlL-24作用于A375細(xì)胞48h的IC50(50％抑制率的濃度)是160gg／ml。FCM檢測顯示rhlL-24可使A

6、375細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，并出現(xiàn)凋亡峰，凋亡率為27．6％。在CAM血管生成抑制實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)顯示rhlL-24、EGCG與平陽霉素均可顯著抑制血管新生。其中對(duì)2級(jí)和3級(jí)血管的抑制效果明顯，與PBS陰性對(duì)照組相比較，差異顯著。成功建立了人A375細(xì)胞黑色素瘤裸鼠移植瘤模型，rhlL-24治療組治療前6d，與PBS陰性對(duì)照組相比，腫瘤體積差異不明顯，而治療6d后差異逐漸顯著。rhlL-24治療組的抑瘤率為42．4％。腫瘤組織的免疫組化檢測顯

7、示rhlL-24治療組與PBS陰性對(duì)照組相比，BAX表達(dá)顯著上升，BCL-2的表達(dá)下降，說明腫瘤細(xì)胞生長受抑制，凋亡率上升；腫瘤細(xì)胞胞漿中VEGF的表達(dá)和瘤體組織中CD34標(biāo)記的微血管密度(MVD)，與陰性對(duì)照組比較，也顯著下降，說明rhlL-24治療組腫瘤細(xì)胞分泌VEGF下降、腫瘤血管生長被明顯抑制。 研究結(jié)論： 1．構(gòu)建了pET-21a(+)/hlL-24重組原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中能高效表達(dá)rhlL-24，并獲得

8、初步純化的rhlL-24。 2．rhlL-24具有免疫刺激作用，能刺激PBMC增加IL-6、IFN-~及TNF-(I的分泌；rhlL-24對(duì)雞胚CAM微血管新生有抑制作用。 3．rhlL-24對(duì)人A375黑色素瘤細(xì)胞的生長抑制作用具有顯著時(shí)間依賴性和劑量依賴性，作用48h的IC50是160gg／mlo 4．rhlL-24可使A375細(xì)胞出現(xiàn)G1阻滯，并出現(xiàn)凋亡峰。 5．經(jīng)rhlL-24治療的人黑色素瘤裸鼠