基于固定化酶技術的蛋白超聲輔助酶解反應及其機理研究.pdf

1、近年來，超聲輔助蛋白酶解制備多肽成為研究的熱點。大量的研究發(fā)現(xiàn)，超聲波對酶解反應過程有顯著的促進作用，但超聲強化蛋白酶解的機制尚不完善。目前報道的研究主要集中在超盧預處理對底物蛋白可酶解性的影響和對蛋白酶活性的影響，關于在超聲場進行酶解反應（稱其為超聲輔助酶解）的機理研究欠缺，其根本原因在于酶與蛋白混合在一起，分別獲取蛋白和酶的結構特征和性質變化的信息十分困難。本文旨在通過固定化酶技術將蛋白酶固定化，待酶解結束后將蛋白酶與蛋白酶解產(chǎn)物有

2、效分離開來，分別研究超聲波對兩者的分子構象的影響，從而探明超聲強化蛋白酶解反應過程的分子機制與結構特征。
　　本文研究了海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶的酶學性質;以酪蛋白為底物，研究了固定化酶的最適反應條件并基于此結論，研究了酶解過程施加超聲對菜籽蛋白酶解效果的影響;采用理化分析、光譜學方法和掃描電鏡等分析測試手段對酶解反應后的蛋白酶與蛋白酶解產(chǎn)物進行結構表征，研究了超聲促進蛋白酶解的反應的分子機制;針對傳統(tǒng)固定化酶載體和技術存在的缺陷

3、，采用磁載體的方式對堿性蛋白酶進行固定化并應用于菜籽蛋白的超聲輔助酶解，進一步探究、驗證了超聲強化蛋白酶解反應的機理。本文得出以下主要結論:
　　(1)通過一種在海藻酸鈉上固定化酶的方法得到固定化堿性蛋白酶，測定蛋白酶的最適pH為10、最適溫度為60℃，獲得的固定化堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性較好。以酪蛋白為模式蛋白，檢驗此固定化堿性蛋白酶的基本性能，判斷能否可用于后續(xù)的超盧輔助酶解機理研究，取得了肯定的效果，并獲得了酪蛋白最

4、佳反應條件為:溫度60℃、pH9.5、底物濃度5％、加酶量960 U/g、酶解時間300 min。
　　(2)以水解度和殘余酶活為指標，進行了菜籽蛋白超聲輔助固定化酶酶解試驗研究。建立影響菜籽蛋白水解度的二次多項回歸方程，在超聲掃頻周期500ms、脈沖超聲工作時間10s、間歇時間3s、超聲酶解初始溫度60℃固定的前提下，經(jīng)過優(yōu)化計算獲得最優(yōu)酶解條件為:酶解時間76 min、功率體積密度57 W/L、料液比0.53 g/100mL、

5、酶底比2100 U/g、超聲頻率68±2/33±2 kHz，在此條件下菜籽蛋白水解度DH為17.80％，比對照提高了近3倍;酶活尚保持在113.32 U/g，是無超聲對照組的1.03倍，與酶解前相比活性損失率為77.13％，因此可以固定化酶可以重復使用。
　　(3)開展了基于固定化酶技術的菜籽蛋白超聲輔助酶解機理研究。超聲輔助固定化堿性蛋白酶酶解菜籽蛋白后，酶解上清液和酶解殘渣的表面疏水性、巰基和二硫鍵含量、紫外光譜、熒光光譜、氨

6、基酸含量、圓二色譜、紅外光譜分析表明，超聲促使了底物蛋白分子螺旋結構伸展，有利于酶解反應的發(fā)生。固定化酶的紅外光譜和掃描電鏡分析表明，超聲波使得蛋白酶的分子結構變得更加有序，催化活性和定向性更高;表面更加粗糙，表面積增大，有利于酶與底物的接觸，反應速率加快。
　　(4)通過一種在殼聚糖磁載體上固定堿性蛋白酶的方法得到固定化酶，測得此固定化酶的操作穩(wěn)定性較好，并用此在超聲場酶解菜籽蛋白，水解度提高25％;在酶解過程中，超聲波對底物蛋