MCMV嗜神經(jīng)蛋白M122和M112-113與腦組織中宿主因子相互作用的研究.pdf

1、【目的】尋找小鼠腦組織中分別與MCMV 嗜神經(jīng)蛋白即刻早期蛋白M122和早期蛋白M112-113 存在相互作用的宿主因子，為闡明M122和M112-113 蛋白在MCMV 感染導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)異常的分子機制中的具體作用提供線索。
　　 【方法】
　　 1.誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建：采用RT-PCR的方法擴增MCMV的M122和M112-113基因片段，將其分別插入至載體pMD18-T simple 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-M

2、122和pMD18-T-M112-113，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI 將重組質(zhì)粒酶切鑒定，并測序；將測序正確的pMD18-T-M122和pMD18-T-M112-113 重組質(zhì)粒與空載體pGBKT7-BD分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI 進行雙酶切，凝膠回收M122和M112-113基因片段及pGBKT7-BD 載體片段；將回收的M122和M112-113基因片段分別與pGBKT7-BD 載體片段，用T4 DNA連接酶16

3、℃連接過夜，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113，并對其進行酶切鑒定和測序；
　　 2.誘餌質(zhì)粒自激活作用和毒性作用檢測：將測序正確的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113分別用小規(guī)模醋酸鋰法轉(zhuǎn)化AH109 酵母感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌液涂布于色氨酸缺陷培養(yǎng)基（SD/-Trp）平板和鋪有X-a-Gal的SD/-Trp（SD/-Trp/X-a-Gal）平板，30℃培養(yǎng)3-5d后觀察平

4、板上菌落的顏色、數(shù)量及大小；
　　 3.融合蛋白表達(dá)的驗證：采用Western bloting 方法驗證誘餌蛋白pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113在酵母細(xì)胞中的表達(dá)；
　　 4.酵母雙雜交篩選：將含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-M122和 pGBKT7-M112-113的AH109菌株分別與含有小鼠腦cDNA文庫的Y187 菌株進行配合，涂板于色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基(SD/-Trp/-

5、Leu/-His/-Ade)或色氨酸、亮氨酸和組氨酸營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His）進行篩選；
　　 5.陽性克隆質(zhì)粒的分離及生物信息學(xué)分析：將篩選到的陽性克隆重復(fù)三次重新劃線于鋪有X-a-Gal的色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤缺陷培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-Gal），以分離得到真正含有相互作用蛋白的酵母菌；挑取單個的藍(lán)色陽性克隆提取酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴增，再次提取質(zhì)粒并

6、測序，測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫進行序列比對和分析；
　　 6.回返驗證及文庫自激活作用的檢測：將獲得的陽性文庫質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒一對一轉(zhuǎn)化AH109 酵母菌株，重新驗證其在酵母中的相互作用，陽性文庫質(zhì)粒與空載體pGBKT7-BD 亦采用同樣方法被同時轉(zhuǎn)入AH109 感受態(tài)細(xì)胞，以排除陽性文庫質(zhì)粒的自激活作用；
　　 7.相互作用蛋白在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)相互作用的驗證：采用化學(xué)發(fā)光免疫共沉淀技術(shù)驗證M122 蛋白與Stx8、At

7、p1b3、Kcnab1、Ankrd17和Myst4 間的相互作用；
　　 8.M122 相互作用位點的定位：構(gòu)建7 種表達(dá)不同長度M122 片段的誘餌質(zhì)粒，分別與pGADT7-Stx8、pGADT7-Atp1b3、pGADT7-Kcnab1、pGADT7-Ankrd17和pGADT7-Myst4 共同轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞，通過營養(yǎng)缺陷篩選確定M122與Stx8、Atp1b3、Kcnab1、Ankrd17和Myst4 相互作用的

8、作用位點。
　　 【結(jié)果】
　　 1.成功構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113，經(jīng)酶切鑒定及測序證實，插入片段大小正確，序列比對顯示與MCMV M122和M112-113基因的核苷酸序列一致；
　　 2.誘餌質(zhì)粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113 成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞AH109中，兩者均無自激活作用，且對酵母細(xì)胞無毒性作用；
　　 3.誘餌質(zhì)粒pGB

9、KT7-M122和pGBKT7-M112-113 能夠在酵母細(xì)胞AH109中穩(wěn)定表達(dá)蛋白；
　　 4.篩選出與M122 相互作用蛋白分子24 種，其中，21 種為已知基因編碼蛋白和3 種為未知基因編碼蛋白；而與M112-113 蛋白存在相互作用的蛋白分子有3 種；
　　 5.回返驗證實驗進一步證實這些蛋白與M122或M112-113 蛋白能夠在酵母細(xì)胞AH109 發(fā)生相互作用；但以M122 為誘餌篩選出的蛋白分子Aplg

10、1和Cul1和以M112-113 為誘餌篩選出的蛋白分子Pias2 被證實具有自激活作用；
　　 6.化學(xué)發(fā)光法免疫共沉淀技術(shù)證實M122與Stx8、Atp1b3、Kcnab1、Ankrd17和Myst4存在相互作用；
　　 7.M122與Stx8、Atp1b3、Kcnab1、Ankrd17和Myst4 相互作用的作用位點的分析顯示，M122 N 末端1-148個氨基酸是產(chǎn)生相互作用的重要區(qū)域。
　　 【結(jié)論】<

11、br>　　 1.成功構(gòu)建用于酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113，且證實兩者均不具有自激活作用，對酵母菌株AH109 亦無毒性，能夠用于篩選宿主細(xì)胞中與MCMV 嗜神經(jīng)蛋白M122或M112-113 存在相互作用的蛋白分子；
　　 2.篩選出MCMV即刻早期蛋白M122和早期蛋白M112-113在腦組織中的互作分子，為闡明M122和M112-113 蛋白在MCMV 感染導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)異常