輻射致傷HSG細胞后MBD2對AQP5表達調控及機制研究.pdf

1、臨床實踐表明：口腔頜面部惡性腫瘤(鼻咽癌、口腔癌和咽喉癌)患者，經放射治療后，往往損傷唾液腺導致進行性唾液分泌減少，出現(xiàn)口干癥狀，其臨床表現(xiàn)與干燥綜合征(Sjogren's syndrome，SS)十分類似。干燥綜合征(SS)是一類慢性自身免疫性疾病。病因學研究發(fā)現(xiàn)：水通道蛋白5(AQP5)的合成和表達異常與SS的發(fā)病密切相關，其表達降低是導致SS唾液分泌異常的重要原因。有研究表明：DNA甲基化參與了AQP5表達調控，是AQP5基因表達

2、受抑的重要機制。去甲基化酶(MBD2)是DNA甲基化的重要組成部分。具有甲基化沉默能力的基因，又具去甲基化酶活性的DNA甲基化調控蛋白，在多種腫瘤的表觀遺傳學調控中扮演著重要角色。經生物學軟件測試分析，作為甲基化體系中的重要組成部分，去甲基化酶MBD2(methyl-CpG binding domain2)可以調控AQP5甲基化狀態(tài)，但參與AQP5表達調控及其機制尚不清楚。
　　 目的：為驗證MBD2與AQP5的分子調控關系。建

3、立輻射致傷頜下腺細胞(humansubmandibular gland，HSG)模型，通過MBD2調控途徑，定向控制和調高AQP5的合成與表達，初步探討MBD2在AQP5表達調控中的相互作用及調控機理，為干燥綜合征的臨床治療提供新的視角。
　　 方法：在前期AQP5和SS相關研究及生物信息學測試分析的基礎上，本課題在分子、細胞的層次研究二者關系。首先，通過構建電離輻射致傷人頜下腺(humansubmandibular gland

4、，HSG)細胞模型。利用免疫熒光、RT-PCR、western-blot的方法檢測HSG細胞系在輻射前后AQP5的差異表達。然后，通過構建MBD2腺病毒過表達載體并轉染到HSG細胞系中，為了證明MBD2對AQP5的調控關系，利用RT-PCR、western-blot的方法驗證AQP5的表達水平的變化。
　　 結果：1、成功構建電離輻射致傷人頜下腺(human submandibular gland，HSG)細胞模型。2、通過RT

5、-PCR、western-blot、免疫熒光的方法證明：AQP5在60鈷γ射線輻射后，無論是其mRNA水平，還是蛋白質水平的表達都會被抑制。3、成功構建MBD2的腺病毒表達載體。4、在HSG細胞系中，MBD2能夠促進AQP5的表達。
　　 本實驗，通過對HSG細胞模型的研究，以RT-PCR、免疫熒光技術、蛋白印跡技術研究AQP5在不同條件下的表達水平。初步判定MBD2與AQP5的表達關系。在后續(xù)實驗中，借助于雙熒光啟動子報告系統(tǒng)