318例中國(guó)漢族非綜合征型聾病人群三個(gè)耳聾基因突變頻譜分析.pdf

1、目的：
　　1.收集溫州醫(yī)學(xué)院各大合作醫(yī)院門(mén)診患者的臨床資料，了解非綜合征型聽(tīng)力損失(nonsyndromic hearing loss，NSHL)的發(fā)病情況。
　　2.通過(guò)統(tǒng)一的調(diào)查方法、標(biāo)本采集，利用基因診斷方法對(duì)門(mén)診非綜合征型耳聾患者及其家系成員進(jìn)行線(xiàn)粒體12S rRNA基因和核基因GJB3口GJB6基因突變檢測(cè)，繪制基因突變頻譜，分析這3個(gè)基因突變?cè)贜SHI發(fā)病中的作用。
　　3.對(duì)攜帶有A1555G和C149

2、4T突變的患者進(jìn)行線(xiàn)粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)全序列的擴(kuò)增，尋找新的mtDNA繼發(fā)突變、多態(tài)性位點(diǎn)及mtDNA單倍型分析。
　　4.通過(guò)對(duì)攜帶GJB3和GJB6基因突變的中國(guó)耳聾家系進(jìn)行臨床、遺傳和分子生物學(xué)特征分析，探討突變位點(diǎn)與耳聾的關(guān)系，為耳聾相關(guān)基因的篩查、耳聾診斷及預(yù)防提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集溫州醫(yī)學(xué)院各合作醫(yī)院耳聾患者血樣318例。并進(jìn)行詳細(xì)的臨床資料分析，建立

3、臨床和分子遺傳學(xué)資料數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　2.采集無(wú)親緣關(guān)系正常對(duì)照人群血樣本。
　　3.提取所采集血液樣本的全基因組DNA。
　　4.通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerise chain reaction，PCR)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)線(xiàn)粒體12SrRNA和核基因GJB3、GJB6基因區(qū)域進(jìn)行突變篩查。
　　5.PCR產(chǎn)物純化后直接進(jìn)行測(cè)序分析。
　　6.繪制非綜合征型耳聾患者線(xiàn)粒體12S rRNA和核基因GJB3、GJB6基

4、因突變頻譜。
　　7.對(duì)攜帶GJB3和GJB6基因突變的中國(guó)漢族耳聾家系進(jìn)行系譜分析，收集臨床相關(guān)資料并進(jìn)行聽(tīng)力學(xué)檢查，分析其他可能的因素對(duì)這些家系耳聾外顯率的影響。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)已收集的318例門(mén)診非綜合征型耳聾患者進(jìn)行線(xiàn)粒體12S rRNA基因篩查，共檢測(cè)出線(xiàn)粒體12S rRNA基因上34個(gè)已知的突變位點(diǎn)，其中A1555G、C1494T和T1095C突變分別占9.1％、0.6%和1.25%。其中A839G

5、和T1452C突變位于12S rRNA基因的高度保守區(qū)域且未在正常對(duì)照中發(fā)現(xiàn)，可能增加了耳毒性藥物的敏感性。
　　2.對(duì)已收集的318例門(mén)診非綜合征型耳聾患者進(jìn)行核基因GJB3和GJB6突變篩查，共發(fā)現(xiàn)GJB3基因上10個(gè)變異(5個(gè)為新變異)位點(diǎn)。其中6個(gè)(G250A，C301T，C310T，A544T，G547A，G580A)為錯(cuò)義突變，4個(gè)(G57A，C243T，C357T，C798T)為無(wú)義突變。結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析顯示新變異

6、C301T、A544T突變和已知變異G547A、G250A突變位于GJB3基因高度保守區(qū)域且沒(méi)有在正常對(duì)照人群中發(fā)現(xiàn)，可能與非綜合征型耳聾相關(guān)。其他變異可能為多態(tài)性變異。攜帶GJB3基因變異的13位患者中，只有1例攜帶C243T變異的患者攜帶了GJB2基因235 delC雜合突變。
　　3.318例門(mén)診非綜合征型耳聾患者GJB6基因突變篩查共發(fā)現(xiàn)2個(gè)變異位點(diǎn)，其中1個(gè)為228del G雜合突變，該突變導(dǎo)致終止密碼子提前至第81位，

7、翻譯的多肽與野生型蛋白相比截短了181個(gè)氨基酸。在19個(gè)物種中進(jìn)行Cx30氨基酸序列保守性分析證實(shí)，該位點(diǎn)保守性為100%；另外1例攜帶GJB6基因G630A雜合點(diǎn)突變，為同義突變L210L，保守性為94.7%。對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)這兩種突變。
　　4.我們分析了線(xiàn)粒體12S rRNA基因和核基因GJB3和GJB6上各個(gè)突變位點(diǎn)與耳聾表型之間的關(guān)系；明確了中國(guó)NSHI門(mén)診病例線(xiàn)粒體12S rRNA和核基因GJB3和GJB6的突變發(fā)生頻率

8、；繪制了中國(guó)NSHI人群線(xiàn)粒體12S rRNA基因和核基因GJB3和GJB6的突變頻譜。
　　5.318例中國(guó)漢族NSHI人群中未發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶線(xiàn)粒體12S rRNA、GJB3和GJB6基因變異的患者。
　　結(jié)論：
　　1.線(xiàn)粒體12S rRNA基因突變篩查發(fā)現(xiàn)，與藥物性耳聾相關(guān)的A1555G突變有29例，C1494T突變只檢測(cè)出1例，而在449名正常對(duì)照的線(xiàn)粒體DNA中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該突變，說(shuō)明這兩種突變是藥物性耳聾的主要

9、致病形式。線(xiàn)粒體DNA繼發(fā)突變、線(xiàn)粒體DNA多態(tài)性及其他核修飾基因可能對(duì)這些耳聾家系的表型表達(dá)起到修飾作用。這些數(shù)據(jù)為氨基糖甙類(lèi)抗生素耳毒性和非綜合征型耳聾的預(yù)防和耳聾基因診斷的開(kāi)展提供可靠的依據(jù)。
　　2.GJB3基因篩查發(fā)現(xiàn)的可能的致病突變均為雜合形式，提示GJB3基因可能以雜合突變形式影響中國(guó)人群聽(tīng)力情況，該基因突變患者的耳聾表型表達(dá)還可能與其他因素如線(xiàn)粒體單倍型、其它核修飾基因或環(huán)境等有關(guān)。我們的數(shù)據(jù)為研究中國(guó)漢族非綜合征

10、型聾病人群的致聾因素提供了有價(jià)值的信息和技術(shù)。
　　3.GJB6基因篩查共發(fā)現(xiàn)2例變異，說(shuō)明GJB6基因突變?cè)诒狙芯咳巳褐凶儺愵l率較低，可能是由于樣本量不夠大或GJB6基因在中國(guó)人群中突變率本身就低，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來(lái)驗(yàn)證。對(duì)已發(fā)現(xiàn)的228 del G雜合突變的致病性，仍需要進(jìn)一步功能驗(yàn)證。
　　4.本項(xiàng)工作為隱性遺傳性非綜合征型耳聾的分子診斷提供了可靠的方法，對(duì)聾病產(chǎn)前診斷、遺傳篩查和遺傳咨詢(xún)提供理論依據(jù)，為開(kāi)展耳聾