海洋真菌Cochliobolus lunatus中十四元大環(huán)內(nèi)酯及其抗污損和殺菌作用.pdf

1、珊瑚礁低等無(wú)脊椎動(dòng)物在激烈的生存競(jìng)爭(zhēng)中演化形成了獨(dú)特的化學(xué)防御機(jī)制,這些生物產(chǎn)生的化學(xué)防御物質(zhì)是尋找發(fā)現(xiàn)海洋防污劑、殺菌劑及殺蟲(chóng)劑等的重要資源。本研究組從中國(guó)南海珊瑚、海葵、海綿等低等無(wú)脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了一系列具有抗污損、殺菌、殺蟲(chóng)、抑藻等活性的化合物。然而受到資源限制,無(wú)法獲得大量活性化合物。生態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中的共附生微生物可能參與了宿主次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成。受此啟發(fā),本研究從海洋共附生真菌中篩選發(fā)現(xiàn)抗污損、殺菌活性化合

2、物,為海洋天然防污劑、農(nóng)業(yè)殺菌劑的研究開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料。
　　以2株海洋來(lái)源真菌 Cochliobolus lunatus(M351)和 C. lunatus(TA26-46)為研究對(duì)象,分離鑒定了14個(gè)十四元二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯(resorcylic acid lactones,簡(jiǎn)稱(chēng) RALs)化合物,其中新化合物7個(gè),新天然產(chǎn)物1個(gè),通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾獲得30個(gè)衍生物。對(duì)分離獲得的化合物及其衍生物進(jìn)行了抗污損、抗農(nóng)業(yè)致病真菌等生物活

3、性研究,獲得抗污損活性化合物14個(gè),初步探討了構(gòu)效關(guān)系;獲得抗農(nóng)業(yè)致病真菌活性化合物2個(gè),并探討了其殺菌作用機(jī)制。
　　1.真菌C. lunatus(M351)中十四元大環(huán)內(nèi)酯分離、鑒定及其抗污損活性
　　本研究組前期從一種蕾二歧燈芯柳珊瑚 Dichotella gemmacea中獲得一系列具有顯著抗污損活性的 Briarane型二萜化合物,啟示我們從柳珊瑚共附生真菌中篩選發(fā)現(xiàn)抗污損化合物。本研究從柳珊瑚 D. gemmac

4、ea中分離共附生真菌,在抗藤壺 Balanidae Amphitrite幼蟲(chóng)附著活性指導(dǎo)下,選擇一株真菌 C. lunatus(M351)進(jìn)行研究。對(duì)該菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),綜合運(yùn)用各種分離手段和波譜學(xué)技術(shù),分離鑒定了7個(gè)十四元大環(huán)內(nèi)酯(1–7)。其中,1–3為新化合物,1和2的結(jié)構(gòu)中含有自然界罕見(jiàn)的丙酮叉片段,3為罕見(jiàn)的鹵代十四元大環(huán)內(nèi)酯。抗藤壺幼蟲(chóng)附著活性結(jié)果表明,在無(wú)毒濃度下,化合物1、4、5、7具有顯著的抗污損活性,EC50值分別為1

5、.2、5.0、5.3、17.9μg/mL,遠(yuǎn)低于美國(guó)海軍規(guī)定的潛在天然抗污損化合物 EC50值低于25μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)?；钚曰衔?、4、5均具有較高的功效毒性比,LC50/EC50分別>16.7、>20.0、>18.9(當(dāng) LC50/EC50>15時(shí),可視為無(wú)毒抗污損化合物),因此這些化合物具備發(fā)展成為新型無(wú)毒高效天然防污劑的潛力。
　　2.真菌 C. lunatus(TA26-46)中十四元大環(huán)內(nèi)酯分離、鑒定、結(jié)構(gòu)修飾及其抗污

6、損、殺菌作用
　　基于十四元大環(huán)內(nèi)酯獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及顯著的抗污損活性,本研究試圖對(duì)該類(lèi)化合物進(jìn)行深入研究。然而,真菌 C. lunatus(M351)代謝不穩(wěn)定,再次發(fā)酵未獲得目標(biāo)化合物。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研、形態(tài)學(xué)比較、分子鑒定,并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行 HPLC-UV,NMR分析,從本實(shí)驗(yàn)室的海洋真菌庫(kù)中獲得了另一株能夠產(chǎn)生十四元大環(huán)內(nèi)酯的真菌 C. lunatus(TA26-46),該菌分離自中國(guó)南海?？鸓alythoa haddoni。

7、通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化,確定使用大米固體培養(yǎng)基進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵。從發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了12個(gè)十四元大環(huán)內(nèi)酯(1、4–14),包括4個(gè)新化合物(8–10、12)。8–11為非對(duì)映異構(gòu)體,區(qū)別在于 C-4′,C-5′構(gòu)型不同,運(yùn)用 CD激子手性法以及 ECD法確定了這4個(gè)化合物的絕對(duì)構(gòu)型?；衔?2為罕見(jiàn) C-8′位有羥基取代的十四元大環(huán)內(nèi)酯,從生源合成的角度考慮,確定了 C-4′,C-5′構(gòu)型,C-8′的絕對(duì)構(gòu)型由于受到化合物量的限制尚未確定。通

8、過(guò)結(jié)構(gòu)修飾獲得30個(gè)衍生物。
　　采用抗藤壺幼蟲(chóng)附著、抗農(nóng)業(yè)致病真菌等活性模型對(duì)分離獲得的化合物及其衍生物進(jìn)行活性篩選。在抗藤壺幼蟲(chóng)附著活性中,化合物1a、1b、4j、6、6d、6f、8、10、11、13具有顯著的抗污損活性,EC50值分別為15.4、12.5、9.0、1.82、3.85、10.5、17.3、6.67、18.1、22.5μg/mL(EC50<25μg/mL),且 LC50/EC50>15,具備開(kāi)發(fā)為高效、低毒、環(huán)境

9、友好型天然防污劑的潛力。構(gòu)效關(guān)系分析表明,羥基、順式烯酮片段、丙酮叉片段等為活性基團(tuán)。在抗農(nóng)業(yè)致病真菌活性測(cè)試中,6顯示了強(qiáng)殺菌活性。在對(duì)感染致病疫霉菌 Phytophthora infestans的馬鈴薯進(jìn)行預(yù)防性葉面噴灑試驗(yàn)中,當(dāng)濃度為200、60和20 ppm時(shí),殺菌率分別為98％、98%和92%,與陽(yáng)性對(duì)照甲霜靈活性相當(dāng)(98%、98%和98%);在對(duì)感染致病疫霉菌 P. infestans的番茄進(jìn)行灌溉試驗(yàn)中,當(dāng)濃度為6 pp

10、m時(shí),殺菌率為86%;更顯著的是,在對(duì)感染霜霉病菌 Plasmopara viticola的葡萄進(jìn)行預(yù)防性葉面噴灑試驗(yàn)中,6的活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照甲霜靈,當(dāng)濃度為6 ppm時(shí),殺菌率為91%,而甲霜靈對(duì)該菌的殺菌率為0。此外,化合物6的殺菌作用機(jī)制是一個(gè)尚未闡明的新的作用機(jī)理。
　　本研究的創(chuàng)新性體現(xiàn)在:從海洋低等無(wú)脊椎動(dòng)物及其共附生微生物的化學(xué)防御機(jī)制出發(fā),尋找高效、低毒、天然海洋防污劑和農(nóng)業(yè)殺菌劑;從柳珊瑚和?？哺缴婢蟹蛛x獲