HCPT誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞線粒體凋亡的比較蛋白質(zhì)組分析與AIF功能研究.pdf

1、目的: 建立羥基喜樹堿(Hydroxycamptothecin，HCPT)誘導(dǎo)的肝癌SMMC-7721細(xì)胞線粒體凋亡模型，運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定線粒體凋亡前后的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，為從亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步闡明HCPT誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)理奠定基礎(chǔ)；并對(duì)其中篩選出的差異蛋白-凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)進(jìn)行功能研究。 策略與方法: 1．確定線粒體凋亡時(shí)相：用HC

2、PT處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞，通過光鏡、MTT實(shí)驗(yàn)、電鏡、流式細(xì)胞儀和AO/EB雙染等方法分別在定性、定量、早期與晚期等不同層面上檢測(cè)HCT的致腫瘤細(xì)胞凋亡活性；通過線粒體跨膜電位、激光共聚焦與western blot法等檢測(cè)線粒體凋亡的時(shí)相變化，并確定線粒體凋亡時(shí)相。 2．線粒體純度鑒定：用線粒體組分分離試劑盒分離肝癌SMMC-7721細(xì)胞線粒體，用詹納斯綠B染料對(duì)分離的線粒體進(jìn)行染色鑒定；分別用核蛋白Histone、細(xì)

3、胞骨架蛋白β-actin、溶酶體蛋白Cathepsin-D和熱休克蛋白HSP60作為細(xì)胞核、細(xì)胞漿、溶酶體和線粒體的特異標(biāo)志蛋白，用western blot對(duì)分離的線粒體進(jìn)行純度鑒定。 3．運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組分析線粒體凋亡前后的差異表達(dá)蛋白譜：通過優(yōu)化各種條件參數(shù)來確定合適的樣品上樣量、染色方法與膠條種類。按蛋白質(zhì)溶解度不同將線粒體蛋白分成三個(gè)組分，對(duì)三個(gè)組份分別進(jìn)行雙向電泳分離。用PDquest(7.0)軟件對(duì)掃描的二維凝膠電泳

4、圖像進(jìn)行分析，篩選出線粒體凋亡前后的差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)。候選差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)胰酶酶解，MALDI-TOF-MS分析，得到肽指紋圖譜(peptide mass fingerprinting，PMF)，使用．Mascot軟件在MSDB數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 4．AIF是篩選出的差異表達(dá)蛋白之一，探究在HCPT致細(xì)胞凋亡的過程中，AIF凋亡途徑是否參與其中：在用HCPI處理SMMC-77

5、21細(xì)胞后，分別用RT-PCR、westem blot法檢測(cè)AIF在mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化；用激光共聚焦與western blot法等檢測(cè)AIF發(fā)生亞細(xì)胞器轉(zhuǎn)位的時(shí)相變化；用DNA ladder試驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷情況。 5．AIF相互作用蛋白質(zhì)的篩選：RT-PCR擴(kuò)增剪切掉線粒體定位信號(hào)的人AIF基因片段并克隆入。pcDNA3.1載體，導(dǎo)入肝癌SMMC-7721細(xì)胞后分別通過RT-PCR、western blot法檢測(cè)A

6、IF在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上的表達(dá)情況。提取轉(zhuǎn)染外源AIF的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，用免疫沉淀方法分離與AIF可能存在相互作用的蛋白質(zhì)：用MALDI-TOF-MS對(duì)分離得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定；再次用免疫共沉淀法與western blot法對(duì)篩選出的可能相互作用蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。 6．AIF蛋白的原核表達(dá)、純化及生物學(xué)活性分析：通過次序嚴(yán)密的分步克隆，將AIF基因片段亞克隆入原核表達(dá)載體pET32a(+)中。進(jìn)行酶切與測(cè)序鑒定后，以構(gòu)建正

7、確的重組質(zhì)粒pET32a．AIF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)菌株，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)重組AIF蛋白，表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE和western blot進(jìn)行鑒定；采用鎳柱親和層析法純化目的蛋白；采用凝膠滯后試驗(yàn)與Hoechst染色檢測(cè)重組蛋白AIF的生物學(xué)活性。 結(jié)果: 1．HCPT對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，半數(shù)抑制濃度(50％inhibitory concentration，IC50)約是

8、80μg/ml。當(dāng)用80μg/mlHCPT對(duì)細(xì)胞處理不同時(shí)間后，細(xì)胞可發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)變化：細(xì)胞膜的磷脂酰絲氨酸外翻，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，呈致密濃染的凋亡狀態(tài)；超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)線粒體出現(xiàn)了腫脹性變化，線粒體跨膜電位下降并伴隨有CytC從線粒體至細(xì)胞漿的釋放。 2．分離的線粒體經(jīng)詹納斯綠B染色后，呈藍(lán)綠色的顆粒狀或棒狀結(jié)構(gòu)；western blot結(jié)果表明：提取的線粒體組分檢測(cè)到了線粒體標(biāo)志蛋白HSP60，而檢測(cè)不到細(xì)胞核標(biāo)志蛋白H

9、istone、細(xì)胞漿標(biāo)志蛋白β-actin與溶酶體標(biāo)志蛋白Cathepsin-D。 3．通過優(yōu)化條件，最終確定合適的樣品上樣量為200μg、最佳染色方法為銀染、最佳膠條為非線性pH3～10膠條。通過對(duì)線粒體凋亡前后的二維凝膠電泳圖像進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)約有39個(gè)蛋白斑點(diǎn)表達(dá)有差異，對(duì)其中25個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析后，鑒定出了20種可能的差異表達(dá)蛋白。 4．HCPT處理SMMC-7721細(xì)胞后，全細(xì)胞

10、中AIF在mRNA與總蛋白質(zhì)表達(dá)水平上無(wú)變化。激光共聚焦及亞細(xì)胞器水平上的westernblot檢測(cè)結(jié)果均表明：HCPT處理細(xì)胞后，AIF從線粒體釋放并遷移至細(xì)胞核。伴隨AIF的核遷移，核DNA出現(xiàn)了損傷。 5．轉(zhuǎn)染的外源AIF基因，可在肝癌SMMC-7721細(xì)胞中成功表達(dá)。用免疫沉淀方法在轉(zhuǎn)染AIF的細(xì)胞中分離到了8個(gè)蛋白條帶，在對(duì)照細(xì)胞中分離到了7個(gè)與轉(zhuǎn)染組相同的蛋白條帶，并對(duì)其中一蛋白條帶進(jìn)行了鑒定，此蛋白為β-actin

11、。 6．人AIF基因能在PET表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)；純化的重組蛋白AIF與DNA能有效在體外結(jié)合；重組蛋白AIF可誘導(dǎo)細(xì)胞核發(fā)生凋亡。 結(jié)論: 1．HCPT可通過Cgc依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。 2．線粒體純度鑒定試驗(yàn)說明：提取的細(xì)胞器組份是線粒體并且線粒體純度較高，可用于下游的蛋白質(zhì)組分析。 3．鑒定出的20種差異表達(dá)蛋白可能在HCPT誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑中起重要作用。 4．HCP