選擇復制型腺病毒SG500介導突變型Dm-dNK基因治療乳腺癌的研究.pdf

1、目的：
　　 乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，根據(jù)近年的統(tǒng)計，美國女性新發(fā)腫瘤中，乳腺癌占據(jù)首位。在發(fā)達國家其發(fā)病率隨著年齡的增長而增加。在過去十年里中國的乳腺癌發(fā)病率穩(wěn)步增加且更年輕。目前外科切除或聯(lián)合系統(tǒng)化療對乳腺癌患者是有效的，但效果并不滿意。化療是腫瘤綜合療法的方法之一，廣泛用于術前、術中及術后。當乳腺癌發(fā)生轉移時其治療特別困難。惡性腫瘤的基因治療是一種有可能根治惡性腫瘤而不損傷正常組織的特殊治療手段。1986年Freder

2、id Moolten首次描述了自殺基因療法，現(xiàn)在已發(fā)展為重要的且最具潛力的腫瘤新興治療方法之一。通過rAAV/TRE/HSV-TK/GCV/DOX阿霉素系統(tǒng)聯(lián)合化療藥物治療乳腺癌體內外實驗結果顯示，這種帶有靶向TRE(tetracycline-responsive element)啟動子的載體系統(tǒng)聯(lián)合適當?shù)幕煴葐斡闷渲腥魏我环N療法的療效更好，自殺基因可能對乳腺癌產(chǎn)生很好的殺傷效果。
　　 在自殺基因療法中，將某些病毒、細菌中特

3、有的前藥物轉換酶基因-通過病毒等載體導入腫瘤細胞，自殺基因編碼的特異性酶類將無毒的藥物前體在腫瘤細胞內代謝成毒性產(chǎn)物達到殺死腫瘤細胞的目的。目前基因治療系統(tǒng)有多種，應用于實體腫瘤治療研究較多的有：單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊環(huán)鳥苷(HSV-TK/GCV)系統(tǒng)、細菌胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系統(tǒng)、水痘-帶狀皰疹病毒胸苷激酶/5-(2-溴乙烯)-2-脫氧尿苷(VZV-TK/BVDU)系統(tǒng)，而單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶

4、/戊環(huán)鳥苷(HSV-TK/GCV)系統(tǒng)目前應用較為廣泛。GCV本身無毒性，是一種核苷酸類似物，在TK作用下形成GCV單磷酸鹽(GCV-MP)，然后在細胞內再轉化為三磷酸鹽(GCV-TP)的形式，作為鏈終止劑，阻止單鏈DNA延長，使細胞周期停滯在S期，抑制細胞分裂并使其死亡，GCV-TP對增殖中的哺乳細胞具有高度毒性。哺乳動物細胞自身的胸腺嘧啶激酶可以催化GCV的轉化，而HSV-TK的作用更強，超過前者200倍。自殺基因對包括肝癌、乳腺癌

5、、大腸癌、黑色素瘤、胰腺癌、腦膠質瘤及卵巢癌的治療效率已被許多腫瘤的細胞實驗和動物實驗證實。盡管自殺基因的治療效果在基礎實驗中被肯定，但在臨床上的應用仍存在殺傷效率有限及安全使用問題。從臨床應用安全角度考慮，理想的腫瘤自殺基因治療即要有效性，又要安全性，而安全性的關鍵在于其真正做到靶向性表達，從而殺滅腫瘤細胞，又使正常組織免于受到損傷。E1B55Kda蛋白和p53蛋白調控腺病毒在宿主細胞中的復制，其主要機制是病毒在宿主細胞的復制被p53

6、蛋白抑制，而宿主細胞p53被E1B55K蛋白抑制，從而使腺病毒的復制能夠在宿主細胞中順利進行。具有靶向瘤裂解功能的腺病毒ONYX-015(d11520)是一種E1B55K基因缺失的腺病毒，由于不能表達E1B55Kda蛋白，從而使p53蛋白功能不能被抑制，因此在p53功能正常的細胞中不能復制，但在p53功能缺陷的腫瘤細胞中其可以復制。因此理想載體的選擇對治療基因能否安全、高效地導入腫瘤細胞是腫瘤基因治療成功極為重要的一環(huán)。
　　

7、人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)表達于細胞永生化過程中具有端粒酶活性的細胞中，絕大多數(shù)人惡性腫瘤細胞中端粒酶活化而正常體細胞檢測不到。缺氧反應元件(hypoxia response element，HRE)啟動子的活化是實體腫瘤特異性的改變，可以使得外源基因在腫瘤細胞內表達，而在正常細胞內表達量極微，據(jù)此可以作為腫瘤特異性的靶向啟動子。
　　 選擇復制型

8、腺病毒SG500中早期轉錄單位E1A和E1B區(qū)之前分別加上了hTERT和HRE(hypoxia response element缺氧反應元件)，且SG500與ONYX-015相似，能在p53功能缺失的腫瘤細胞中復制，并將后者殺死；而SG500含有克隆位點可以插入外源基因而成為SG500-gene，而ONYX-015無克隆位點。因此SG500做為載體能夠使外源基因靶向的在腫瘤細胞中轉錄，實現(xiàn)了多重靶向。
　　 Dm-dNK(mul

9、tisubstrate deoxyribonucleoside kinase of Drosophila melanogaster)基因即黑腹果蠅多底物脫氧核苷酸激酶基因是一種新的自殺基因。Munch-Petersen等從果蠅身上提純了這種基因表達的激酶，并發(fā)現(xiàn)它能夠催化自然界所有嘌呤、嘧啶脫氧核糖核酸的磷酸化反應，具有廣泛的底物特異性，還表現(xiàn)出驚人的催化效率，高出目前了解的核酸激酶效率的10-100倍，這種特殊性使其成為激酶家族的獨特

10、成員。Zheng等對其是否可以用做分子化療的基因做了評估，發(fā)現(xiàn)它產(chǎn)生的激酶能對某些抗病毒或抗腫瘤藥物，如核苷酸類似物(nucleoside analog)，起到有效的磷酸化作用。研究者使Dm-dNK在癌細胞種系中表達并且起到一種自殺基因的作用，成功證明了這種酶在癌細胞表達的可能性以及其在癌細胞中仍然保持著較高的酶活性，不僅如此Dm-dNK還增加了癌細胞對某些化療藥物的敏感性。有研究顯示突變可以提高自殺基因Dm-dNK的酶活性，從而更高效

11、殺傷細胞。
　　 我們在果蠅多底物脫氧核糖核苷酸激酶氨基酸序列中最后10位予以隨機突變，突變后的氨基酸分別為第244位谷氨酸、245位絲氨酸、251位絲氨酸、252位蘇氨酸，形成一個突變型果蠅多底物脫氧核苷酸激酶(Dm-dNKmu)。利用選擇復制型腺病毒SG500做為載體將突變型多底物脫氧核糖核苷酸激酶(Dm-dNKmu)基因導入乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7加入不同濃度的不同核苷類藥物作用腫瘤細胞。并運用RT-P

12、CR、酶活性測定分析其表達產(chǎn)物，運用MTT、CPE及病毒增殖實驗在不同水平檢驗SG500-CMV-Dm-dNKmu對腫瘤細胞的殺傷效果及其安全性。進而做荷瘤小鼠的體內試驗，觀察SG500-CMV-Dm-dNKmu聯(lián)合核苷酸類似物在動物實驗中的安全性和敏感性。探討這種治療體系對于乳腺癌細胞殺傷作用，為治療乳腺癌提供新思路。
　　 方法：
　　 一、選擇復制型腺病毒載體質粒SG500-CMV-dNKmu構建及轉染
　　

13、 pENTR-12載體在CMV啟動子與加尾信號之間含有多克隆位點，HindⅢ、EcoRI、EcoRV、Xbal、XhoI、BamHI。通過基因操作方法將腫瘤治療基因Dm-dNKmu，順向插入到pENTR-12的多克隆位點，構建成PENTR12-Dm-dNKmu質粒。該質粒與PPE3-ccdB重組，用Lipofectamine2000將PPE3-CMV-DNKmu質粒與SG502共轉染至293細胞，9-14天出現(xiàn)病毒空斑，應用QIAGE

14、N DNA BloodMini Kit提取腺病毒DNA，通過PCR驗證后命名為SG500-CMV-DNKmu，即CMV調控的帶DNKmu基因的E1B55kDa基因缺失的腫瘤特異性增殖型腺病毒。復制缺陷5型腺病毒Ad-GFP用于比較不同細胞系間感染率的區(qū)別。
　　 二、酶活性測定
　　 通過提取細胞的蛋白，用放射性[3H]標記作為底物的核苷酸藥物，混合液在Whatman DE-81濾紙上反應不同時間后經(jīng)液閃測量儀測定放射活

15、性。
　　 三、Dm-dNKmu基因的表達
　　 用TRIZOL方法提取純化SG500-CMV-DNKmu病毒感染后的人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7；人胚肺成纖維上皮細胞株MRC-5、WI38，使用反轉錄PCR試劑盒對目的基因的表達進行檢測。
　　 四、SG500-CMV-dNKmu聯(lián)合核苷酸類似物在體外對乳腺癌細胞的殺傷作用
　　 人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7和正常細胞W

16、I-38、MRC-5鋪96孔板，培養(yǎng)基在第二天分別替換為病毒溶液SG500-CMV-dNKmu和SG500，感染72h后分別加前藥dFdC和BVDU濃度梯度為0.1μM至100μM，加藥后4天結束實驗，采用MTT法檢測細胞增殖情況。每個實驗至少做三次
　　 采用Annexin V-FITC雙染凋亡檢測試劑盒觀察治療后細胞凋亡情況及凋亡比例。乳腺癌細胞MDA-MB-231和正常細胞MRC-5細胞鋪6孔板分別感染病毒SG500-CM

17、V-dNKmu，SG500加入核苷酸藥物dFdC和BVDU處理，經(jīng)AnnexinV-FITC和碘化丙錠雙重染色后用流式細胞儀分析凋亡比例。
　　 五、SG500-CMV-dNKmu聯(lián)合Dfdc或Bvdu抑制腺病毒增殖
　　 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231、MCF7、WI-38、MRC-5細胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，按MOI=1加入病毒，設SG500-CMV-dNKmu組、SG500組。24h后加入前藥dFdC、BVD

18、U濃度為(10μM)感染后收集病毒感染96h的細胞及上清液，-80℃凍融三次；離心，取上清，收獲病毒。利用腎成纖維細胞293通過TCID50(tissue culture infectious dose)方法檢測病毒滴度在藥物處理前后的變化。
　　 同樣細胞經(jīng)過病毒及藥物的干預方法如上，利用細胞裂解液提取細胞蛋白，通過Western Blot蛋白雜交法檢測病毒早期轉錄單位蛋白EIA在治療前后的變化。
　　 六、SG500

19、-CMV-DNKmu聯(lián)合Dfdc對裸鼠移植瘤的抑制作用
　　 取30只BaIb/c裸小鼠，右側腋下接種生長良好的MDA-MB-231細胞懸液。待長出50-100mm3直徑的腫瘤后(一周左右)，隨機分為3組，實驗組10只：瘤體內注射SG500-CMV-dNKmu，隔天注射1次，注射10天后，第2-10天腹腔注射DFDC1mg/kg/d。對照組20只：10只注射SG500-CMV-dNKmu同實驗組，第2-10天腹腔注射PBS共注射

20、9次；10只瘤體內注射PBS，方法同實驗組觀察裸鼠生存及腫瘤大小，用游標卡尺測量腫瘤短徑(a)、長徑(b)，按公式V=ab2/2計算腫瘤體積，按下式計算抑瘤率：抑瘤率=[(對照組腫瘤的平均體積-實驗組腫瘤的平均體積)/對照組腫瘤的平均體積]×100％，并通過免疫組織化學法檢測早期轉錄單位EIA表達。
　　 結果：
　　 一、選擇復制型腺病毒載體質粒SG500-CMV-dNKmu構建及轉染：
　　 通過基因操作方法

21、將腫瘤治療基因Dm-dNKmu，順向插入到pENTR-12的多克隆位點，構建成PENTR12-Dm-dNKmu質粒。該質粒與PPE3-ccdB重組，用Lipofectamine2000將PPE3-CMV-DNKmu質粒與SG502共轉染至293細胞，應用PCR進行鑒定。電泳證實CMV啟動子長度為521bp，Dm-dNKmu序列長度為779bp。由表達綠色熒光蛋白的野生5型腺病毒(Ad5-GFP)感染來確定病毒對細胞系的感染率。結果乳腺癌

22、細胞系MDA-MB-231、MCF7正常細胞系WI-38、MRC-5表現(xiàn)出基本相同的感染率。
　　 二、Dm-dNK基因的表達及酶活性的檢測
　　 重組腺病毒SG500-CMV-dNKmu感染細胞后的激酶活性檢測結果，感染后的乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7酶活性明顯高于沒有感染病毒的乳腺癌空白細胞系，分別高29倍和21倍，高出重組腺病毒SG500-CMV-dNKmu感染正常細胞MRC-5、WI38酶活性的近

23、10倍。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒SG500-CMV dNKmu乳腺癌細胞Dm-dNKmu基因高表達，在正常細胞低表達。
　　 三、Dm-dNKmu基因聯(lián)合核苷類似物對乳腺癌細胞的殺傷作用
　　 通過MTT及流式細胞儀檢測凋亡的體外實驗證實SG500-CMV-dNKmu對乳腺癌細胞選擇性殺傷作用。MTT結果顯示：SG500-CMV-dNKmu病毒和SG500病毒分別感染乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和

24、正常細胞系MRC-5，WI-38，SG500-CMV-dNKmu與SG500相比，前者聯(lián)合Bvdu或Dfdc更能有效的殺傷乳腺癌細胞(p<0.05)，然而在正常細胞中，SG500-CMV-dNKmu與SG500相比，二者聯(lián)合Bvdu或Dfdc對正常細胞MRC-5，WI-38殺傷效果無差異(p>0.05)。而且Dfdc比Bvdu對Dm-dNKmu的底物特異性更高。AnnexinV-PI雙染流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，SG500-CMV-dNKmu

25、感染后分別加Dfdc和Bvdu能夠誘導近73%和61%的乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡，而對正常細胞MRC-5影響輕微，對照空載病毒SG500聯(lián)合Dfdc和Bvdu殺傷效果小。
　　 四、SG500-CMV-dNKmu聯(lián)合Dfdc或Bvdu抑制腺病毒增殖
　　 TCID50方法檢測病毒SG500-CMV-dNKmu、SG500、d11520和WtAd感染后的乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和正常細胞系MR

26、C-5，WI-38，加入不同化療藥物Dfdc和Bvdu，收集加藥后的細胞及上清檢測病毒滴度變化，在乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7中，SG500-CMV-dNKmu聯(lián)合Dfdc和Bvdu治療病毒滴度均下降，而Dfdc下降最為明顯，其他病毒沒有發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象。Western Blot方法對病毒早期轉錄單位E1A的檢測也證實了這一點，由于SG500-CMV-dNKmu的選擇性表達，SG500-CMV-dNKmu感染后E1A僅在乳腺

27、癌細胞中表達，SG500-CMV-dNKmu聯(lián)合Dfdc和Bvdu使E1A表達明顯降低，而正常細胞中，SG500-CMV-dNKmu的E1A表達并不明顯。
　　 五、Dm-dNKmu基因聯(lián)合核苷類似物對裸鼠移植瘤的抑制作用
　　 SG500-CMV-dNKmu聯(lián)合Dfdc對裸鼠MDA-MB-231乳腺癌細胞轉移瘤治療。注射PBS的對照組腫瘤體積明顯增大，而注射腺病毒SG500-CMV-dNKmu組，尤其是SG500-CM

28、V-dNKmu聯(lián)合Dfdc處理組腫瘤增長得到明顯抑制。體內試驗結果與體外實驗相吻合。然而SG500-CMV-dNKmu聯(lián)合Dfdc處理組與以上兩組相比，瘤體生長在治療21天后明顯被抑制(P<0.05)。
　　 六、SG500-CMV-DNKmu聯(lián)合Dfdc延長移植瘤裸鼠生存期
　　 SG500-CMV-dNKmu/Dfdc系統(tǒng)對轉有DM-dNKmu的乳腺癌MDA-MB-231細胞轉移瘤治療后裸鼠的生存期較MDA-MB-2

29、31轉移瘤PBS處理組，MDA-MB-231轉移瘤SG500-CMV-dNKmu處理組延長。
　　 結論：
　　 1.選擇復制型腺病毒SG500能在體外成功感染人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7，且具有較高的轉染效率。SG500載體在人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7中的復制具有腫瘤特異性，這可能跟人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7端粒酶活化或p53功能缺失有關。SG500載體能夠在腫

30、瘤的基因治療中安全、高效的使用。
　　 2.Dm-dNKmu激酶基因可以在人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7中高水平表達，并仍能保持高的蛋白激酶活性。
　　 3.SG500-CMV-dNKmu聯(lián)合Dfdc或Bvdu對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7具有明顯的生長抑制作用，且具有時間-劑量依賴關系。并且溶瘤腺病毒SG500-CMV-dNKmu對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7的生長抑制作

31、用是通過誘導細胞凋亡來實現(xiàn)。
　　 4.SG500-CMV-dNKmu與Dfdc或Bvdu聯(lián)合使用，可以提高自殺基因對乳腺癌細胞的靶向性選擇，由于自殺基因高效的催化活性，可以克服傳統(tǒng)化療毒副作用大的缺點，增強治療效果。自殺基因磷酸化Dfdc或Bvdu后限制病毒的播散，有望解決病毒使用安全性問題。
　　 5.在裸鼠體內移植瘤實驗中，SG500-CMV-dNKmu/Dfdc治療組有效抑制了裸鼠乳腺癌移植瘤的生長，同時延長裸鼠