系統(tǒng)性紅斑狼瘡中Blimp1的表達(dá)及其對(duì)BCMA的調(diào)控研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一種典型的可累及全身多器官系統(tǒng)的自身免疫性疾病，其主要的免疫學(xué)特征是自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞的多克隆活化增殖，機(jī)體產(chǎn)生大量自身抗體，并以循環(huán)免疫復(fù)合物的形式沉積于組織和器官，導(dǎo)致組織器官損害。其確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。自身抗體被認(rèn)為在SLE的發(fā)病中起著重要的作用。目前臨床上治療SLE的主要措施仍是使用激素和非特異性免疫抑制劑，如糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺

2、等。盡管這些藥物能廣泛地抑制免疫活性細(xì)胞，有效地控制疾病病程，但毒副作用明顯。另外由于自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞在用藥后持續(xù)存在，難以達(dá)到治愈SLE的目的。由于血清中多克隆自身抗體的存在是SLE的基本病理特征，表明產(chǎn)生自身抗體的B細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。因此，清除或抑制B細(xì)胞的功能是治療SLE的新方向。近年來(lái)靶向B淋巴細(xì)胞治療SLE取得了很大進(jìn)展，然而由于漿細(xì)胞是致病性自身抗體的直接來(lái)源，僅僅針對(duì)可分裂的B細(xì)胞，不能清除自身

3、抗體的根本來(lái)源，導(dǎo)致患者病情反復(fù)發(fā)作，無(wú)助于疾病的痊愈。可見(jiàn)僅僅針對(duì)B淋巴細(xì)胞治療SLE難以避免疾病的復(fù)發(fā)。研究表明，CD20、BAFF兩種耗竭B細(xì)胞治療SLE的方法中，在B細(xì)胞終末分化為漿細(xì)胞時(shí)消失，即CD20單抗和BAFF抑制劑不能清除漿細(xì)胞，而40％自身抗體分泌性漿細(xì)胞是長(zhǎng)壽命的，長(zhǎng)壽漿細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體可再次激活潛在的病理免疫應(yīng)答反應(yīng)?？梢?jiàn)，要使SLE長(zhǎng)期得以緩解，還需要抑制漿細(xì)胞（包括長(zhǎng)壽漿細(xì)胞）及其功能，直接清除或減少自身抗

4、體產(chǎn)生來(lái)源，使治療SLE產(chǎn)生更為有效、持久的效果。所以尋求影響漿細(xì)胞存活及其功能的特異靶標(biāo)是治療SLE的關(guān)鍵。
　　 轉(zhuǎn)錄因子Blimp1(B-lymphocyte-induced maturation protein1)是具有5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的98KD蛋白，是誘導(dǎo)成熟B淋巴細(xì)胞終末分化為漿細(xì)胞并分泌抗體的主調(diào)控子，是漿細(xì)胞形成和免疫球蛋白分泌所必需的轉(zhuǎn)錄因子，也是維持骨髓中長(zhǎng)壽漿細(xì)胞所必需的轉(zhuǎn)錄因子，是維持長(zhǎng)期抗原特異免疫反應(yīng)所必

5、需。目前Blimp1維持漿細(xì)胞存活及抗體分泌的機(jī)制尚不清楚，在LPS誘導(dǎo)小鼠原代B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞的過(guò)程中，Blimp1的表達(dá)顯著增高，這可能同B淋巴細(xì)胞分化的調(diào)控密切相關(guān)。我們的前期研究采用RNA干擾技術(shù)抑制Blimp1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞的表型細(xì)胞J558L中Blimp1受抑制后，其表面標(biāo)記CD138表達(dá)下降，而原本不表達(dá)的B淋巴細(xì)胞免疫標(biāo)記CD19開(kāi)始出現(xiàn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)與維持漿細(xì)胞存活、免疫球蛋白(Ig)分泌功能相關(guān)的BCMA、XB

6、P-1及J鏈表達(dá)下降，可見(jiàn)漿細(xì)胞中Blimp1被抑制后，漿細(xì)胞發(fā)育程序出現(xiàn)再編程，發(fā)生了去分化現(xiàn)象。這些研究提示，Blimp1是維持漿細(xì)胞存活及功能的關(guān)鍵因子，以Blimp1為靶標(biāo)的抑制性分子將可能通過(guò)抑制抗體的產(chǎn)生，用于抗體所致免疫性疾病的治療，從而有望用于SLE等自身免疫性疾病的治療。
　　 B細(xì)胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)為B細(xì)胞表面分子，屬于腫瘤壞死因子受體家族(TNFR)，

7、屬于缺少信號(hào)肽的Ⅰ型跨膜信號(hào)蛋白，它可分別與B細(xì)胞激活因子BAFF或APRIL(a proliferation induced ligand)兩種配體相結(jié)合。BAFF的其他兩個(gè)受體TACI和BAFF-R在B淋巴細(xì)胞發(fā)育及自身免疫性疾病發(fā)病中的作用都有較系統(tǒng)的研究。BCMA主要在成熟B細(xì)胞、漿細(xì)胞表面表達(dá)，由184個(gè)氨基酸殘基組成，其胞內(nèi)區(qū)含80個(gè)氨基酸殘基，胞外區(qū)序列很短，只有一個(gè)CRD。BCMA在B細(xì)胞的作用機(jī)制尚未完全闡明。BCMA

8、基因剔除小鼠免疫系統(tǒng)表現(xiàn)正常，有正常的脾結(jié)構(gòu)，B淋巴細(xì)胞的發(fā)育正常，針對(duì)外來(lái)抗原的體液免疫TI和TD也未見(jiàn)明顯異常，但漿細(xì)胞數(shù)量明顯減少，證明BCMA在維持漿細(xì)胞的存活中起了重要的作用，其可能機(jī)制是BCMA與BAFF蛋白結(jié)合，并上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2，Mcl-1及Bclw等，維持細(xì)胞生長(zhǎng)。阻斷BCMA可選擇性地抑制漿細(xì)胞的存活，從而成為治療SLE的潛在靶點(diǎn)。那么，既然Blimp1、BCMA都為影響漿細(xì)胞存活的重要因子，它們之間有何聯(lián)系

9、，如何調(diào)控漿細(xì)胞存活及功能呢？哪一種可能是治療SLE更有效的靶標(biāo)？
　　 分析B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)Blimp1與BCMA都隨著B(niǎo)細(xì)胞的發(fā)育成熟而出現(xiàn)，并且表達(dá)量都逐漸增加，且都只表達(dá)于成熟B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞階段，皆為維持漿細(xì)胞存活所必需，在B細(xì)胞發(fā)育的時(shí)空性上表現(xiàn)出驚人的一致。Blimp1調(diào)節(jié)的直接靶基因，被證實(shí)的有c-myc、C(II)TA、Pax-5、Spi-B及Id3等，對(duì)Blimp1結(jié)合已知靶基因的核苷酸序列分

10、析得知，Blimp1對(duì)已知靶基因的結(jié)合位點(diǎn)都有相似的序列，為“NNNNGAAAGNN”。分析BCMA基因的上游調(diào)控序列，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)可能的Blimp1結(jié)合序列，分別位于“-46～-36”、“-31～-21”位。國(guó)內(nèi)外對(duì)Blimp1與BCMA相互調(diào)控機(jī)制研究還很少，近期有研究表明Blimp1對(duì)BCMA基因具有激活作用，且劑量與活性正相關(guān)，在BCMA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。將BCMA基因5’上游“-46～-36”、“-31～-21”位序列兩

11、個(gè)可能的Blimp1結(jié)合位點(diǎn)，采用定點(diǎn)突變技術(shù)，進(jìn)行相應(yīng)的替代突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“-38～-42”位的“GAAAC”位點(diǎn)，影響B(tài)limp1對(duì)BCMA啟動(dòng)子的識(shí)別，可能為Blimp1結(jié)合BCMA啟動(dòng)子的位點(diǎn)。Blimp1蛋白對(duì)BCMA啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用可能與維持漿細(xì)胞的存活機(jī)制相關(guān)。基于以上原因，我們提出Blimp1可能通過(guò)與BCMA“-38～-42”位的“GAAAC”位點(diǎn)結(jié)合，直接調(diào)控BCMA表達(dá)，并在維持漿細(xì)胞存活及抗體分泌中發(fā)揮主導(dǎo)作用。

12、漿細(xì)胞的存活必需Blimp1、BCMA、XBP-1的持續(xù)表達(dá)，已證實(shí)XBP-1為Blimp1的下游分子，如BCMA也為Blimp1下游分子，則Blimp1處于主調(diào)控子的地位。抑制Blimp1能阻抑自身免疫中漿細(xì)胞功能，促進(jìn)漿細(xì)胞凋亡，進(jìn)而為開(kāi)發(fā)治療SLE等自身免疫性疾病的新藥奠定基礎(chǔ)。
　　 SLE是以多克隆B細(xì)胞活化，多種自身抗體大量產(chǎn)生為特征所致的抗體性疾病，Blimp1在漿細(xì)胞分化處于主調(diào)控子的地位。因此，阻斷Blimp1

13、的表達(dá)或活性，有可能影響長(zhǎng)壽漿細(xì)胞的存活，減少抗體產(chǎn)生，降低抗原抗體導(dǎo)致的免疫反應(yīng)從而達(dá)到治療SLE的目的。目前Blimp1在SLE中的作用研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。研究Blimp1基因在SLE中的表達(dá)并進(jìn)一步研究其在SLE治療中的作用，對(duì)于進(jìn)一步從新的角度探索新的治療方案具有重要意義。
　　 目的：
　　 1、探討B(tài)limp1對(duì)BCMA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，明確維持漿細(xì)胞存活的兩個(gè)重要因子Blimp1與BCMA間的關(guān)系，了解Bli

14、mp1、BCMA維持漿細(xì)胞存活及抗體分泌的作用機(jī)制。
　　 2、研究Blimp1在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的表達(dá)情況，為開(kāi)發(fā)靶向漿細(xì)胞治療SLE等自身免疫性疾病的新藥奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 1、Blimp1對(duì)BCMA的調(diào)控:
　　 1)凝膠移動(dòng)抑制分析實(shí)驗(yàn)(EMSA)
　　 采用具有漿細(xì)胞表型的小鼠骨髓瘤細(xì)胞J558L細(xì)胞，提取細(xì)胞核蛋白，設(shè)計(jì)5’生物素標(biāo)記的BCMA探針。雙鏈探針與核蛋白提取物

15、孵育，結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行非變性PAGE電泳，化學(xué)發(fā)光顯影，采用Blimp1抗體進(jìn)行超移動(dòng)抑制分析。
　　 2)染色質(zhì)免疫沉淀分析(CHIP)
　　 1％甲醛處理結(jié)合在DNA上的轉(zhuǎn)錄因子交聯(lián)，超聲破碎，采用抗Blimp1抗體孵育，蛋白G沉淀，收集抗體-轉(zhuǎn)錄因子-DNA復(fù)合物，逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，對(duì)純化DNA進(jìn)行PCR分析，檢測(cè)能否擴(kuò)出目的片段。
　　 2、MRL/(l)pr狼瘡小鼠Blimp1的表達(dá):實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PC

16、R)
　　 分別取MRL/(l)pr狼瘡小鼠及正常老鼠的淋巴結(jié)和脾臟，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。通過(guò)熔解曲線確定PCR產(chǎn)物的特異性，取兩管平均Ct值計(jì)算2-△△CT值，作為各標(biāo)本mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料呈非正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用中位數(shù)(Median)(四分位數(shù)間距IQR)描述，兩組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(Mann-WhitneyTe

17、st)分析，以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、Blimp1能夠與BCMA特異性結(jié)合。EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了J558L細(xì)胞的核蛋白與“-38～-42”位的“GAAAC”位點(diǎn)結(jié)合形成了DNA-核蛋白復(fù)合物，且競(jìng)爭(zhēng)性探針可以抑制此復(fù)合物的形成。加入抗Blimp1抗體時(shí)出現(xiàn)超阻滯條帶。CHIP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了J558L細(xì)胞中Blimp1蛋白能與BCMA基因DNA結(jié)合。
　　 2、狼瘡鼠組脾臟Blimp1m

18、RNA的相對(duì)表達(dá)水平高于正常對(duì)照組Blimp1mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。其中位數(shù)（四分位數(shù)間距）分別為0.655(0.426，0.799)和0.966(0.777，1.314)(Z=-2.609，P=0.009);狼瘡鼠組淋巴結(jié)中Blimp1的相對(duì)表達(dá)水平也高于正常對(duì)照組Blimp1mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，中位數(shù)（四分位間距）分別為1.786(1.127，3.119)和7.338(6.482，10.199)(Z=-3.402，P=0.00

19、1)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、Blimp1是漿細(xì)胞終極分化和存活的主調(diào)控子，可以直接調(diào)控BCMA基因表達(dá)，在維持漿細(xì)胞存活和功能中發(fā)揮重要作用。
　　 2、Blimp1mRNA表達(dá)在SLE狼瘡鼠的脾臟、淋巴結(jié)中明顯高于正常對(duì)照，提示Blimp1可能與SLE的發(fā)病過(guò)程相關(guān)，抑制Blimp1可能阻抑自身免疫中漿細(xì)胞功能，為開(kāi)發(fā)治療SLE等自身免疫性疾病的新藥奠定基礎(chǔ)。Blimp1將成為靶向漿細(xì)胞治