β1整合素的表達(dá)純化及在篩查幽門螺桿菌與之結(jié)合蛋白中的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）近年來被認(rèn)為是一種兼性胞內(nèi)菌，它不僅能侵入細(xì)胞，而且可在細(xì)胞內(nèi)繁殖和產(chǎn)生毒素。已有研究證實(shí)，Hp可通過細(xì)胞表面的β1整合素介導(dǎo)而侵入胃上皮細(xì)胞，但與此相關(guān)的細(xì)菌蛋白及其相應(yīng)作用目前尚不清楚。本課題旨在通過原核表達(dá)純化技術(shù)，獲得可溶性的β1整合素蛋白。將制備好的β1整合素蛋白和本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的HpT7噬菌體展示cDNA文庫親和淘洗篩選，獲得與β1整合素相互作用的

2、Hp蛋白DNA序列，為下一步研究和β1整合素相互作用的蛋白以及相關(guān)功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　?、購腉ENBANK獲得β1整合素CDS區(qū)序列，保留β1整合素的胞外膜區(qū)，截掉β1整合素的N端信號(hào)肽序列。
　　②分析β1整合素的稀有密碼子分布情況，優(yōu)化β1整合素的稀有密碼子。參照β1整合素的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu),優(yōu)化TIR的密碼子。
　?、廴蚝铣搔?整合素序列并插入到克隆載體 pUC18。分別將 pUC18-β1-

3、integrin質(zhì)粒和pET30a載體雙酶切，回收后的片段使用T4連接酶連接。
　?、躳ET30a-β1-integrin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)感受態(tài)，挑取陽性單克隆誘導(dǎo)表達(dá)并SDS-PAGE電泳分析其表達(dá)情況。
　?、萑”４娴木暾T導(dǎo)后超聲破菌收集上清，SDS-PAGE電泳分析蛋白的可溶性。
　?、拚T導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)并收集包涵體，包涵體破碎和溶解后過Ni-NTA柱，用含不同濃度的咪唑洗脫液洗脫，收集各個(gè)濃度的洗脫液并

4、SDS-PAGE電泳分析。
　?、邔⑷芙獾牡鞍籽b入透析袋，先以復(fù)性液透析三次，再以蛋白貯存液透析三次，濾膜過濾后于冰箱凍存。
　?、嗍褂眉兓摩?整合素篩查HpT7噬菌體展示cDNA文庫。挑取單個(gè)噬菌斑進(jìn)行PCR反應(yīng)，瓊脂糖電泳檢查PCR反應(yīng)產(chǎn)物并回收,T7特異性引物進(jìn)行測序分析。
　　⑨將獲得的序列在NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列比較。
　　結(jié)果：
　?、偃蚝铣?/p>

5、的pUC18-β1-integrin質(zhì)粒單酶切鑒定結(jié)果正確。
　　②構(gòu)建好的pET30a-β1-integrin質(zhì)粒測序結(jié)果正確。
　?、踦ET30a-β1-integrin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后挑取單克隆誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果得出在β1整合素分子量80kD附近有條帶。
　　④SDS-PAGE分析蛋白可溶性得出，β1整合素在上清表達(dá)量很低，大部分以包涵體形式表達(dá)。
　?、萃ㄟ^包涵體變性和復(fù)性得到可溶

6、的β1整合素蛋白，其濃度為0.32mg/ml。Western blot使用his-tag抗體檢測目的蛋白，在其分子量80kD附近有條帶。SDS-PAGE檢測純化好的蛋白，在其分子量80kD附近有單一條帶。蛋白凍融實(shí)驗(yàn)得出目的蛋白凍融后無懸浮物，離心后無明顯沉淀。
　?、轍pT7噬菌體展示cDNA文庫篩選與β1整合素互相結(jié)合的蛋白，測序比對(duì)后得到2個(gè)與β1整合素結(jié)合的預(yù)選蛋白。
　　結(jié)論：
　　①通過原核表達(dá)、純化技術(shù)，