TRPC6調(diào)控腎小管上皮細胞necroptosis在腎I-R中的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　缺血再灌注損傷(I/R)是指組織器官在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流供應(yīng)以后，組織器官的損傷程度反而加重的現(xiàn)象。I/R普遍存在于臨床各科的工作實踐當中，盡管曾經(jīng)有多種I/R的損傷學說被提出，例如:氧異常、鈣異常、PH異常等等。但是，I/R完整的發(fā)病機制迄今為止尚未能得到完全的闡明。腎臟由于其獨特的生理結(jié)構(gòu)和功能特點，是極易受缺血缺氧刺激的影響的靶器官，從而常常因為I/R而發(fā)生急性腎損傷(Acutekidney injury，

2、AKI)。AKI是涉及多個臨床學科的常見急危重癥，不僅在外科領(lǐng)域，如腎移植、腎臟手術(shù)、腎梗阻積水、腎動脈狹窄、栓塞性疾病等，而且在內(nèi)科領(lǐng)域，如各種腎小球疾病的急性期，I/R導(dǎo)致的AKI都是不可避免的腎臟損傷之一。AKI的典型病理改變是急性腎小管壞死，所以目前認為腎小管上皮細胞的損傷在腎臟I/R的過程中居于關(guān)鍵地位。由于I/R發(fā)生發(fā)展的機制尚未能夠完全闡明，導(dǎo)致目前臨床上尚無有效的防治I/R的手段。所以，探討腎臟I/R的機制已成為臨床相關(guān)

3、領(lǐng)域中的重大課題，而努力尋找到一種能夠有效防治腎臟I/R的有效措施，將會產(chǎn)生重大的社會和經(jīng)濟效益。
　　長久以來的傳統(tǒng)觀點認為:凋亡(apoptosis)是一種細胞自我調(diào)控的主動病理生理過程;而壞死(necrosis)則被認為是相對不可逆的細胞死亡過程，難以通過藥理學途徑的干預(yù)得到阻止或者說逆轉(zhuǎn)。然而，目前的研究發(fā)現(xiàn):在細胞壞死的大背景中，至少有相當部分的細胞壞死可以像凋亡那樣，由特定的刺激信號啟動，并且按照一定的信號傳導(dǎo)通路和執(zhí)

4、行程序發(fā)生，具有精密的調(diào)控機制，并被命名為“necroptosis”（程序性壞死，又被譯做壞死性凋亡）。necroptosis的發(fā)現(xiàn)和研究進展使得臨床上對細胞壞死的過程進行調(diào)控成為可能，那就有可能將對生命科學的基礎(chǔ)研究和臨床相關(guān)疾病的治療產(chǎn)生重要的影響。necroptosis已被證實存在于腎臟I/R中，并且研究者們發(fā)現(xiàn)是necroptosis的特異性抑制劑necrostatin-1而不是apoptosis的關(guān)鍵酶Caspase的阻滯劑z

5、VAD能顯著改善腎臟I/R動物模型的組織損害，這就提示我們:necroptosis在腎臟I/R中發(fā)揮了比apoptosis更為重要的作用，在I/R過程中阻斷necroptosis是防治腎臟I/R的新方向。necroptosis的發(fā)生受到脫乙酰酶sirtuin-2的調(diào)控，這是因為sirtuin-2的脫乙酰化作用是necroptosis的關(guān)鍵信號分子受體相互作用蛋白1(receptor-interactingprotein1，RIP1)與受

6、體相互作用蛋白3(receptor-interacting protein3，RIP3)直接互作作用的必要條件。而sirtuin-2的酶活性取決于它的輔因子NAD+的水平。而我們知道，NAD+活性的降低與細胞能量的缺乏和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，由此推斷necroptosis也是受代謝因素調(diào)控的。眾所周知，缺血缺氧和再灌注過程導(dǎo)致的代謝因素的變化在腎I/R的發(fā)生中扮演重要的角色:在腎臟缺血的急性期由于缺氧會發(fā)生NAD+水平的下降甚至耗竭，而再灌

7、注以后NAD+水平將會得到迅速地補充。這就或許可以解釋為何在缺血再灌注的過程中最初并沒有廣泛的細胞死亡，但在再灌注后卻轉(zhuǎn)而發(fā)生。我們推測這可能是因為:再灌注發(fā)生以后NAD+水平會獲得快速地補充，使得sirtuin-2的酶活性升高，RIP1與RIP3的相互作用得到加強，損傷信號加速傳遞，從而促進了necroptosis的發(fā)生;同時，由于necroptosis總是伴發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)，也將通過炎癥因子激發(fā)的“瀑布效應(yīng)”進一步導(dǎo)致細胞的損傷。如

8、果能證實以上推斷，就將為我們打開了一扇機會之窗:通過在再灌注開始前阻斷細胞的necroptosis來阻止腎臟I/R。
　　傳統(tǒng)型瞬時性受體電位通道6(transient receptor potential cation channel，TRPC6)是屬于傳統(tǒng)型瞬時性受體電位通道(TRPC)家族的成員之一，是位于細胞膜上的非選擇性的陽離子通道。TRPC6激活后主要功能是介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，并通過受鈣離子調(diào)控的下游信號傳導(dǎo)通路實現(xiàn)細胞外

9、-內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前的研究證明，TRPC6具有促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細胞發(fā)育和生存的作用，且其表達與體內(nèi)代謝因素調(diào)控的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)氧化酶和活性氧(ROS)的活性有關(guān)，并且在腦缺血、視網(wǎng)膜以及肺的缺血再灌注損傷中也發(fā)揮了重要的作用。TRPC6在人腎小管上皮細胞上表達，我們在前期的預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)TRPC6在腎臟I/R模型中表達也是增加的，并能夠上調(diào)和sirtuin-2具有相同底物NAD+的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(P

10、oly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1)的水平。所以，根據(jù)目前的研究進展和預(yù)實驗結(jié)果，在本研究中，我們從離子通道蛋白與腎臟I/R損傷的關(guān)系入手，擬探索TRPC6在腎臟I/R中調(diào)控necroptosis的作用及其機制，以便為腎臟I/R的防治提供新的思路和新的治療靶點。
　　材料和方法：
　　1、利用基因檢測芯片檢測Brown Norway(BN)大鼠、Sprague Dawley(SD)大鼠腎臟I

11、/R模型差異基因，利用NCBI GEO數(shù)據(jù)庫進行miRNA靶基因網(wǎng)絡(luò)分析、蛋白網(wǎng)絡(luò)模塊分析，篩選出差異基因并預(yù)測其可能的作用。
　　2、免疫熒光染色法測定TRPC6在HK-2細胞中的表達情況。
　　3、按照文獻方法，利用礦物油隔絕氧氣，利用增加了鈣、鎂的PBS孵育阻斷能量供應(yīng)來創(chuàng)建HK-2細胞體外缺血再灌注損傷模型。
　　4、利用RNAI技術(shù)篩選、擴增TRPC6低表達的HK-2細胞。
　　5、利用AnnxinⅤ-

12、FITC/PI試劑盒，使用流式細胞儀檢測HK-2細胞在體外缺血再灌注損傷過程中的壞死/凋亡比例。
　　6、利用western blot方法檢測HK-2細胞TRPC6、RIP1、PARP-1、sirtuin-2、AIF的蛋白表達變化情況。
　　7、利用切除左腎，動脈夾夾閉右腎動脈40min的方法建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷的動物模型。
　　8、利用Olympus AU2700全自動生化分析儀檢測大鼠血清血肌酐水平。

13、　　9、利用腎組織病理HE染色觀察缺血再灌注大鼠腎臟損傷的形態(tài)學變化，并進行腎小管壞死半定量評分。
　　10、利用超敏二步法免疫組化檢測試劑盒進行腎臟組織免疫組化染色，觀察RIP1、RIP3、TRPC6、CaMKII、PARP-1在腎臟組織的表達變化。
　　11、利用Western-blot檢測腎臟組織TRPC6、PARP-1、RIP1、sirtuin-2蛋白表達變化情況。
　　12、利用工具藥:OAG、SKF9636

14、5、KN-93研究TRPC6通道以及CaMKII在信號傳導(dǎo)中的作用。
　　主要結(jié)果：
　　1、篩選出了包括TRPC6在內(nèi)的23個共同表達差異表達基因，并進行了生物信息學分析，我們分別利用信息庫對上調(diào)和下調(diào)差異表達基因進行了miRNA靶基因預(yù)測，并構(gòu)建了預(yù)測的網(wǎng)絡(luò)分析圖。
　　2、HK-2細胞表達TRPC6，并在細胞體外缺血再灌注損傷過程中表達明顯增加。
　　3、HK-2細胞體外缺血再灌注損傷模型中，細胞的死亡以壞

15、死為主，且能被necrostatin-1抑制，說明在這一病理過程中存在necroptosis。
　　4、采用RNAI下調(diào)TRPC6表達的HK-2細胞在體外缺血再灌注損傷模型中的細胞壞死率明顯升高。
　　5、TRPC6激動劑OAG干預(yù)可以使HK-2細胞在體外缺血再灌注損傷模型中的細胞壞死率明顯下降，取得與necroptosis特異性抑制劑nec-1類似的效果;而TRPC6阻斷劑SKF96365和CaMKII抑制劑KN-93干預(yù)

16、，使得HK-2細胞在體外缺血再灌注損傷模型中的細胞壞死率明顯升高。
　　6、體外缺血再灌注損傷模型中，采用RNAI下調(diào)TRPC6表達的HK-2細胞的PARP-1的表達明顯下調(diào);sirtuin-2的表達未受TRPC6下調(diào)的影響;RIP1的表達在TRPC6下調(diào)后明顯升高。
　　7、體外缺血再灌注損傷模型中，OAG干預(yù)組的HK-2細胞的PARP-1表達升高，而SKF96365和KN-93組PARP-1表達下調(diào);RIP1的表達變化與

17、此相反:OAG組RIP1表達下調(diào)，而SKA96365和KN-93組PARP-1表達升高。
　　8、在腎臟缺血再灌注大鼠模型中，TRPC6主要在腎小管上皮細胞表達，腎小球也有表達;再灌注后24、48h TRPC6的表達明顯增多，第5天TRPC6的表達開始減少; PARP-1、RIP1、sirtuin-2的蛋白表達與TRPC6有類似的變化趨勢。
　　9、在腎臟缺血再灌注大鼠模型中，采用OAG干預(yù)的大鼠，血肌酐水平明顯下降;而使用

18、SKF96365、KN-93干預(yù)的大鼠，血肌酐水平與缺血再灌注組相比明顯升高。
　　10、使用OAG干預(yù)后，缺血再灌注大鼠組織PARP-1表達升高、RIP1表達降低;相反，使用SKF96365、KN-93干預(yù)后，缺血再灌注大鼠組織PARP-1表達下降，RIP1表達升高。
　　結(jié)論：
　　1、利用基因檢測芯片檢測差異表達蛋白以及靶基因網(wǎng)絡(luò)分析、蛋白網(wǎng)絡(luò)模塊分析，發(fā)現(xiàn)TRPC6是缺血再灌注損傷的差異基因之一并預(yù)測其可能在調(diào)

19、控缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。
　　2、在HK-2細胞的體外缺血再灌注損傷模型中，TRPC6表達明顯增加，通過CaMKII上調(diào)PARP-1的表達，通過PARP-1與sirtuin-2的競爭作用調(diào)控necroptosis;采用RNAI技術(shù)下調(diào)TRPC6表達的HK-2細胞在體外缺血再灌注損傷模型中壞死率明顯升高，PARP-1表達下降，sirtuin-2表達無明顯變化，而RIP1表達也明顯升高。
　　3、在大鼠腎臟缺血再灌注損傷