白喉毒素-人B細(xì)胞活化因子融合蛋白對人急性白血病BALL-1細(xì)胞殺傷作用實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、第一部分白喉毒素/人B細(xì)胞活化因子融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定及純化
　　 研究背景：
　　 靶向治療的概念最早于1956年由德國化學(xué)家Ehdich提出，當(dāng)前在抗腫瘤藥物研究中腫瘤靶向治療因其特異性強(qiáng)、副作用少等優(yōu)點(diǎn)而成為其中的重要研究領(lǐng)域，其主要作用機(jī)理是：將特異性的靶向載體與毒性物質(zhì)通過一定方法連接起來，靶向載體定向?qū)邢蛑委熕幬镙斔偷侥[瘤部位，毒性物質(zhì)殺傷腫瘤細(xì)胞。毒性物質(zhì)亦稱為“彈頭”，主要包括毒素、放射性同位素和化

2、學(xué)藥物等。腫瘤靶向治療藥物中的免疫毒素由于其載體靶向特異性高和毒素殺傷性強(qiáng)的特性使其成為腫瘤靶向治療研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域。
　　 上世紀(jì)80年代，有研究者根據(jù)靶向治療的理念制造出了第一代免疫毒素，是利用化學(xué)偶聯(lián)的方法將毒素蛋白通過二硫鍵或硫醚鍵偶聯(lián)到與靶向載體上，在動物試驗(yàn)中顯示了全身副作用低靶向殺傷力強(qiáng)的特性，常用的偶聯(lián)劑有：N-琥珀酰亞胺基-3-[2-吡啶二硫基]-丙酸酯(SPDP)、N-羥基琥珀酰亞胺、S-乙酰巰基琥珀酸酐等。

3、隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者利用基因重組技術(shù)將靶向載體與毒素分子重組融合構(gòu)建出重組免疫毒素，此即第二代免疫毒素。研究者還通過基因重組技術(shù)來改良毒素的特性，比如：去除毒素結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞結(jié)合域來降低其非特異性毒性，通過基因突變來提高其殺傷腫瘤細(xì)胞作用等。另一方面，根據(jù)靶抗原的多樣性，研究者利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建出多樣性的載體。從免疫原性和毒性兩個(gè)方面進(jìn)行改造，推動了免疫毒素研究的發(fā)展。
　　 構(gòu)建免疫毒素的毒性分子種類很多，主要有

4、以下幾類：植物性毒素、細(xì)菌性毒素、人源性蛋白毒素、真菌性毒素等。構(gòu)建免疫毒素常用的毒素分子之一白喉毒素(diphtheria toxin，DT)屬于細(xì)菌性毒素，是白喉?xiàng)U菌被β噬菌體溶源化后，由β噬菌體tox基因編碼合成的外毒素，分子全長535aa，分子量為58330 D，分為3個(gè)彼此獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域：酶活性區(qū)(C區(qū))、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)(T區(qū))和膜受體結(jié)合區(qū)(R區(qū))，便于拆分操作，為設(shè)計(jì)免疫毒素提供了有利條件。
　　 利用分子生物學(xué)技術(shù)對白

5、喉毒素進(jìn)行改造以適應(yīng)構(gòu)建免疫毒素的需要，比如采用截?cái)嗟腄T(如DT388、DAB389等)，或者將DT分子中的T區(qū)去除或點(diǎn)突變，這樣就制備出了一系列DT的衍生物或DT的突變體(如CRM9、CRM107)，他們大多保留了C區(qū)和T區(qū)，也就保留了酶活性和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能；通過基因重組技術(shù)將DT分子中的R區(qū)突變失活或刪除，再用能特異性識別腫瘤細(xì)胞表面分子的結(jié)構(gòu)，比如細(xì)胞因子、單克隆抗體等，取代R區(qū)的位置，這樣就能構(gòu)建成白喉毒素類免疫毒素，它既能靶

6、向結(jié)合腫瘤細(xì)胞，又能靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞低毒。根據(jù)腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的特異性受體而對構(gòu)建免疫毒素載體進(jìn)行選擇，無外乎是能與之結(jié)合抗體、細(xì)胞因子及激素等。B細(xì)胞活化因子(B lymphocyte activating factor，BAFF)，也是一種細(xì)胞因子，可以與其在B細(xì)胞系細(xì)胞表面表達(dá)的受體結(jié)合，因此適宜作為免疫毒素的靶向載體。
　　 本研究就是以此為思路，利用截?cái)嗟腄T388與B細(xì)胞活化因子(BAFF)通過基因重組

7、技術(shù)構(gòu)建重組免疫毒素DT388sBAFF。
　　 研究目的：
　　 構(gòu)建免疫毒素白喉毒素/人B細(xì)胞活化因子融合蛋白(DT388sBAFF)表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定并純化。
　　 研究方法：
　　 1.根據(jù)白喉毒素/人B細(xì)胞活化因子(DT388sBAFF)優(yōu)化合成的基因序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增將DT388sBAFF插入到克隆載體pMD19-T，陽性克隆質(zhì)粒通過菌落PCR篩選陽性克隆，提取DNA后經(jīng)限制性內(nèi)

8、切酶雙酶切，最后進(jìn)行DNA測序鑒定確定目的基因序列。
　　 2.陽性克隆質(zhì)粒pMD19-T-DT388sBAFF經(jīng)雙酶切(NdeⅠ、XhoⅠ)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離出目的基因DT388sBAFF，再插入表達(dá)載體pcoldⅡ中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pcoldⅡ-DT388sBAFF，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌株發(fā)酵，后經(jīng)菌落PCR鑒定陽性菌株。
　　 3.將陽性單克隆菌落挑取進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，觀察至對數(shù)生長期后，通過IPTG誘導(dǎo)，行S

9、DS-PAGE分析和Western blot鑒定融合蛋白(DT388sBAFF)。
　　 4.利用Ni2+-NTA層析柱純化融合蛋白DT388sBAFF，后經(jīng)透析，并通過SDS-PAGE分析檢測融合蛋白。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建了人克隆質(zhì)粒pMD19-T-DT388sBAFF，克隆基因序列的測序結(jié)果與目的基因DT388sBAFF序列完全一致。
　　 2.重組表達(dá)載體pcoldⅡ-DT388sBA

10、FF轉(zhuǎn)化BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，超聲破菌，SDS-PAGE結(jié)果顯示包涵體內(nèi)的明顯蛋白條帶出現(xiàn)在58.4KD處，符合目的蛋白DT388sBAFF大小，獲得的融合蛋白通過利用圖像掃描分析，結(jié)果顯示其占菌體總蛋白的比例約為40％，Western blot檢測顯示融合蛋白分別與兩種抗體(抗His-Tag多克隆抗體和抗BAFF多克隆抗體)均發(fā)生了特異性結(jié)合反應(yīng)，這表明獲得的融合蛋白為特異性目的蛋白DT388sBAFF，它以包涵體形式存在。

11、>　　 3.融合蛋白DT388sBAFF利用Ni2+-NTA層析柱進(jìn)行純化，后經(jīng)凝膠圖像掃描分析，最終目的蛋白DT388sBAFF純度達(dá)90％以上。
　　 結(jié)論：
　　 利用基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建了白喉毒素/人B細(xì)胞活化因子(DT388sBAFF)基因原核表達(dá)質(zhì)粒pcoldⅡ-DT388sBAFF，在轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞之后獲得了穩(wěn)定表達(dá)的工程菌株，并且在此過程中對融合蛋白DT388sBAFF的表達(dá)條件、提取包涵體步驟

12、以及其純化工藝等進(jìn)行了探索優(yōu)化。
　　 第二部分白喉毒素/人B細(xì)胞活化因子融合蛋白的生物學(xué)活性檢測
　　 研究背景：
　　 B細(xì)胞活化因子(B lymphocyte activating factor，BAFF)，也被稱為BLyS的(B-淋巴細(xì)胞刺激因子)，TALL-1(TNF-α和APOL相關(guān)白細(xì)胞表達(dá)配體1)，或THANK(腫瘤壞死因子同源物，激活細(xì)胞凋亡，NKFB，和JNK)，是TNF(腫瘤壞死因子)的超家

13、族的成員，表達(dá)在單核細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞(DC)，嗜中性粒細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，活化T細(xì)胞，惡性B細(xì)胞和上皮細(xì)胞等表面。BAFF的受體有三種：BAFF-R，TACI(transmembrane activator and calcium modulator andcyclophilin ligand interactor，跨膜活化劑和鈣的調(diào)制器和親環(huán)素配體相互作用因子)和BCMA(B cell maturation protein，B細(xì)胞的成熟蛋

14、白)，它他們表達(dá)在B細(xì)胞發(fā)育的不同時(shí)區(qū)。BAFF-R主要在更成熟的B細(xì)胞中表達(dá)，從T1的過渡性B細(xì)胞階段開始。然而，最近的研究提出的證據(jù)表明，BAFF-R普遍表達(dá)于B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞，其源于正常B細(xì)胞的祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化發(fā)展。其他的研究表明，構(gòu)建BAFF和白樹種子儲藏蛋白(一種植物毒素)融合蛋白表現(xiàn)出對BAFF-R(+)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用。
　　 融合蛋白對BAFF-R(+)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用取決于

15、兩個(gè)方面，一是融合蛋白與這種細(xì)胞的結(jié)合能力，另一方面是融合蛋白的毒性基團(tuán)對這種細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)合能力主要是由細(xì)胞表面表達(dá)BAFF受體能力決定。Hmy2.CIR細(xì)胞是利用B淋巴母細(xì)胞構(gòu)建的試驗(yàn)用細(xì)胞株。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測Hmy2.CIR細(xì)胞上BAFF受體mRNA表達(dá)水平，利用熒光素標(biāo)記技術(shù)檢測重組免疫毒素與Hmy2.CIR細(xì)胞結(jié)合能力，最后利用細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測重組蛋白對Hmy2.CIR細(xì)胞的殺傷作用。
　　 研究目的：

16、
　　 檢測免疫毒素DT388sBAFF(白喉毒素/人B細(xì)胞活化因子融合蛋白)的生物學(xué)活性。
　　 研究方法：
　　 1.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測B細(xì)胞株Hmy2.CIR細(xì)胞上BAFF三種受體(BAFF-R、TACI和BCMA)的表達(dá)水平。
　　 2.利用FITC熒光素標(biāo)記技術(shù)檢測重組免疫毒素DT388sBAFF與B細(xì)胞株Hmy2.CIR細(xì)胞結(jié)合能力。
　　 3.重組免疫毒素DT388sBA

17、FF對Hmy2.CIR細(xì)胞的殺傷作用的檢測采用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)施。
　　 4.利用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件中的方差分析功能對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.BAFF的三種受體BAFF-R、TACI和BCMA在B細(xì)胞株Hmy2.CIR細(xì)胞都表達(dá)，其中BAFF-R表達(dá)最高。
　　 2.在倒置熒光顯微鏡下可觀察利用FITC熒光素標(biāo)記融合蛋白DT388sBAFF后的Hmy2.CIR細(xì)胞，視野里發(fā)現(xiàn)有較

18、強(qiáng)綠色熒光出現(xiàn)，而對照陰性組U937細(xì)胞視野則未見熒光，此結(jié)果表明融合蛋白DT388sBAFF與表達(dá)于Hmy2.CIR細(xì)胞表面的BAFF受體能夠特異性的結(jié)合。
　　 3.融合蛋白DT388sBAFF對Hmy2.CIR細(xì)胞較強(qiáng)的抑制作用通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果得以顯現(xiàn)，且具有劑量依賴關(guān)系，即隨著融合蛋白DT388sBAFF濃度的增加，Hmy2.CIR細(xì)胞被抑制的效應(yīng)越強(qiáng)(P<0.05)，而不同濃度的融合蛋白DT388sBAFF之于對

19、照陰性組U937細(xì)胞沒有顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的抑制效應(yīng)(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 獲得了具有靶向B細(xì)胞活性的免疫毒素DT388sBAFF，為其在B細(xì)胞惡性腫瘤及自身免疫性疾病治療中的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分白喉毒素/人B細(xì)胞活化因子融合蛋白對人急性白血病BALL-1細(xì)胞殺傷作用
　　 研究背景：
　　 急性白血病(acute leukemia)是兒童常見的血液系統(tǒng)腫瘤，急性淋

20、巴細(xì)胞白血病約占70％，其中80％來源于B細(xì)胞系，其發(fā)生率和病死率均呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類，特別是兒童的健康。通常采用的聯(lián)合化療的治療方法，但這些治療措施抗腫瘤能力低，也就是選擇性差，并有明顯的全身毒副作用。長期使用非特異免疫抑制劑容易誘導(dǎo)藥物耐藥，并可使患者免疫功能受到嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致許多并發(fā)癥。
　　 免疫毒素由于其靶向治療的特點(diǎn)成為當(dāng)前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。免疫毒素主要通過毒性分子中的不同結(jié)構(gòu)域間的協(xié)調(diào)配合而發(fā)揮殺傷

21、作用，其過程主要包括：免疫毒素中的載體發(fā)揮靶向作用與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合；免疫毒素中的毒性分子內(nèi)化入細(xì)胞；毒性分子的活性作用主要是抑制蛋白表達(dá)，以致細(xì)胞死亡。
　　 免疫毒素的毒性部分主要來源有一下幾類：植物來源的毒素、細(xì)菌來源的毒素、人源性蛋白毒素以及真菌來源的毒素等。白喉毒素屬于細(xì)菌來源的毒素，含有于細(xì)胞結(jié)合區(qū)和酶活性區(qū)，C片段是其酶活性區(qū)，主要活性作用是失活核蛋白體上的肽鏈EF-2，從而抑制細(xì)胞合成蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死，應(yīng)用這

22、個(gè)優(yōu)勢特性發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。本研究通過以白喉毒素為毒性部分而構(gòu)建免疫毒素DT388sBAFF來探討其是否對人急性白血病BALL-1細(xì)胞存在抑制作用，從而為急性白血病治療提供新的研究方向。
　　 研究目的：
　　 研究免疫毒素DT388sBAFF(白喉毒素/人B細(xì)胞活化因子融合蛋白)的對人急性白血病BALL-1細(xì)胞的殺傷作用。
　　 研究方法：
　　 1.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測人急性白血病BA

23、LL-1細(xì)胞上BAFF三種受體(BAFF-R、TACI和BCMA)的表達(dá)水平。
　　 2.利用FITC熒光素標(biāo)記技術(shù)檢測重組免疫毒素DT388sBAFF與人急性白血病BALL-1細(xì)胞結(jié)合能力。
　　 3.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測重組免疫毒素DT388sBAFF對人急性白血病BALL-1細(xì)胞的殺傷作用。
　　 4.利用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件中的方差分析功能對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.B

24、AFF的三種受體(BAFF-R、TACI和BCMA)中，只有BAFF-R在人急性白血病BALL-1細(xì)胞上高表達(dá)(P<0.05)，TACI和BCMA基本不表達(dá)(P>0.05)。
　　 2.FITC熒光素標(biāo)記重組免疫毒素DT388sBAFF后在倒置熒光顯微鏡下可觀察到人急性白血病BALL-1細(xì)胞有較強(qiáng)綠色熒光出現(xiàn)，而陰性對照組U937細(xì)胞則未見熒光，而陽性對照Hmy2.CIR細(xì)胞亦出現(xiàn)較強(qiáng)綠色熒光，而且急性白血病BALL-1細(xì)胞和陽

25、性對照Hmy2.CIR細(xì)胞只同時(shí)表達(dá)BAFF一種受體：BAFF-R，這表明重組免疫毒素DT388sBAFF與上述細(xì)胞表面受體BAFF-R具有特異性結(jié)合能力。
　　 3.細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示了較強(qiáng)的抑制效應(yīng)，即重組免疫毒素DT388sBAFF能抑制人急性白血病BALL-1細(xì)胞，且具有劑量依賴關(guān)系，即人急性白血病BALL-1細(xì)胞受抑制作用隨著重組免疫毒素DT388sBAFF濃度的增加，而越強(qiáng)(P<0.05)，這與陽性對照細(xì)胞Hmy