自然殺傷細胞在乙型肝炎肝衰竭中的趨化機制研究.pdf

1、背景：
　　目前乙型肝炎病毒（HBV）在全球約有3.5億感染者,而我國是世界上乙型肝炎病毒（HBV）感染的高發(fā)地區(qū)之一，且由 HBV感染所引起的慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）是我國臨床疾病治療中的常見危重疾病，其比例呈上升的趨勢，該疾病一旦發(fā)生，進展迅速，病情危重，因臨床上缺乏特異、有效的治療手段和干預靶點，且并發(fā)癥多，大部分患者預后不良，死亡率可達70％。對于由乙型肝炎病毒所致的慢加急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展機制的學說很多，但目前

2、比較明確的是，病毒和宿主兩個方面的因素均可影響疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉歸等。其中的病毒方面包括病毒蛋白、基因多態(tài)性以及變異等與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，而宿主方面的基因的多態(tài)性及相關的免疫學因素也可以影響該疾病的發(fā)生和發(fā)展的過程。
　　乙肝慢加急性肝衰竭是一個多因素相互促進、相互制約的復雜過程。免疫細胞及其分泌的多種細胞因子、趨化因子和黏附分子積極參與了乙肝肝衰竭發(fā)生、發(fā)展的過程，并在其中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已證明抗原特異性細胞毒性T細胞（

3、CTL）在肝臟損傷中發(fā)揮重要作用。隨著乙肝肝衰竭發(fā)生機制的進一步深入研究，各種致病因素的作用、相互關系被逐漸的闡明和應用于臨床,前期研究以鼠三型肝炎病毒（MHV-3）誘導的暴發(fā)型肝衰竭小鼠模型為研究對象，發(fā)現(xiàn)了NK細胞具有向肝臟募集的趨勢，隨著MHV-3感染時間的延長，NK細胞逐漸活化，在Fas-FasL途徑和NKG2D-NKG2DL途徑的介導下對感染病毒的肝細胞表現(xiàn)出顯著的殺傷作用，闡明了肝臟NK細胞的作用及機制，表明了在暴發(fā)型肝衰竭

4、中NK細胞發(fā)揮的重要作用。
　　此后，為了進一步研究NK細胞導致肝損傷的病理生理的具體過程，應用基因芯片技術，在鼠三型肝炎病毒（MHV-3）誘導的暴發(fā)型肝衰竭小鼠模型模型中，篩選出具有差異表達的NK細胞趨化因子受體CCR1、CCR5、CXCR3和CXCR4（表1）。并且，在后續(xù)的研究中證明,在MHV-3誘導的小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型中，趨化因子受體CCR5及其相應的配體（MIP-1a、MIP-1β及RANTES）在NK細胞的募集及活化

5、以及隨后的肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起到了十分重要作用。
　　本研究擬在實驗室前期研究結果的基礎上，繼續(xù)探討NK細胞趨化因子受體CCR5及其配體在乙肝慢加急性肝衰竭發(fā)病過程中在NK細胞的趨化和募集過程中所發(fā)揮的作用，進而為闡述和治療乙肝病毒誘導的肝衰竭的肝損傷發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。
　　目的：
　　以NK細胞趨化因子受體CCR5為研究對象，研究乙型慢加急性肝炎肝衰竭患者中NK趨化機制。
　　方法：
　　1、建立乙

6、肝慢加急性肝衰竭患者、輕中度慢乙肝患者、及健康對照的病例對照研究隊列。
　　2、利用流技術細胞術，檢測乙肝慢加急性肝衰竭患者、輕中度慢乙肝患者及健康對照外周血的CCR5+NK細胞數(shù)量，并分析CCR5+NK細胞數(shù)量與疾病嚴重程度的相關性。
　　3、通過酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法（ELISA）技術檢測乙肝慢加急性肝衰竭患者、輕中度慢乙肝患者、及健康對照外周血血清中CCR5的相關配體CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)和C

7、CL5(RANTES)水平。
　　結果：
　　1、乙肝慢加急性肝衰竭患者的外周血NK細胞比例顯著下降，為8.558％（8.558±1.324，P=0.0001），與此相反，而其CCR5+NK增加至40.74％（40.74±3.659，P=0.0002），而輕中度慢乙肝患者的外周血的淋巴細胞中 NK細胞所占的比例為14.14％（14.14±2.307），其CCR5+NK比例為21.14％(21.14±2.583),與健康對照相

8、比，其NK細胞比例無顯著變化（P=0.101）而其CCR5+NK增加不明顯（P=0.3699），而與乙肝慢加急性肝衰竭患者相比其外周血NK細胞比例顯著增加，（8.558±1.324，P=0.0440），與此相反，CCR5+NK顯著減少（40.74±3.659，P=0.0002）。健康對照組的外周血的淋巴細胞中NK細胞所占的比例為19.19％（19.19±1.823），其CCR5+NK比例為16.75％(16.75±4.029)
　

9、　2、通過流式細胞分析技術，可以清楚的區(qū)分出NK細胞及其亞群，分別檢測NK細胞、CD56brightNK細胞CD56dimNK細胞中CCR5+NK細胞的比例,三組的CD56brightNK細胞中CCR5+NK細胞均顯著高于CD56dimNK細胞中CCR5+NK的比例。在乙肝慢加急性肝衰竭患者中，與CD56dimNK細胞中 CCR5+NK細胞百分率（37.48±3.985）相比，相同的，在輕中度慢乙肝患者組中，與 CD56dimNK細胞中

10、CCR5+NK細胞百分率（16.24±3.855）相比，CD56brightNK細胞CCR5+NK顯著增加（58.35±7.313，P<0.0001）,CD56brightNK細胞CCR5+NK顯著增加（65.93±5.135，P<0.0001）健康對照組的CD56brightNK細胞中CCR5+NK細胞比例為40.94％（40.94±6.692）與CD56dimNK細胞中CCR5+NK細胞（14.65±3.855）比顯著增多（P=0.

11、0028）。
　　3、乙肝慢加急性肝衰竭患者外周血NK細胞中CCR5+NK比例與肝損傷嚴重程度有一定的關系，尤其與患者的PTA（％）呈正相關（P=0.0230,R=0.563）,與TBil無明顯相關性（P=0.1073,R=0.4882），與Dbil無明顯相關性（P=0.3948,R=0.2707），與ALT（P=0.0684,R=0.566）和AST（P=0.3740,R=0.2822）也無明顯相關性。
　　4、分別檢測健

12、康對照、輕中度慢乙肝患者和乙肝慢加急性肝衰竭患者的外周血中CCR5相關配體CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)和CCL5(RANTES)的表達水平。結果顯示乙肝肝衰竭患者外周血的CCL3(MIP-1α)的濃度為421.7pg/ml(421.7±60.36),與健康對照(816.3±167.9)顯著減少（P=0.0339）,其CCL5(RANTES)的濃度為14.39ng/ml(14.39±3.404),與健康對照(6.15

13、8±0.8748)顯著增高（P=0.0309）。
　　結論：
　　1、CCR5+NK細胞在乙肝慢加急性肝衰竭患者、慢乙肝患者和健康對照之間存在顯著差異,在乙肝慢加急性肝衰竭的外周血中顯著增加，提示CCR5可能在NK的趨化過程中起到作用；
　　2、外周血CD56brightNK細胞亞群中CCR5+NK細胞比例高于其在CD56dimNK亞群中的比例，提示分泌型的CD56brightNK可能更多的趨化到肝臟發(fā)揮作用；