大鼠短暫局灶性腦缺血后Cathepsin B介導(dǎo)細胞凋亡與JNK信號通路的關(guān)系及法舒地爾對其干預(yù)的研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過 ROCK抑制劑鹽酸法舒地爾(ROCK選擇性的抑制劑)對缺血/再灌注模型的干預(yù)以及檢測和分析cathepsin B與p-JNK之間的蛋白表達的變化、定位的關(guān)系,探討溶酶體組織蛋白酶的促凋亡的分子機制和法舒地爾的藥理抗凋亡的分子機制,可能為缺血性腦卒中的防治提供了新的理論依據(jù)和新的治療方向,有著重要的臨床意義。
　　方法：
　　清潔級健康雄性10-12周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠72

2、只,體重約270±20g,隨機分為假手術(shù)組(sham,n=6)、模型組0h(M-0h, n=6)、模型組2h(M-2h,n=6)、模型組6h(M-6h,n=6)、模型組24h(M-24h,n=6)、模型組48h(M-48h,n=12)、干預(yù)組2h(I-2h, n=6)、干預(yù)組6h(I-6h,n=6)、干預(yù)組24h(I-24h,n=6)和干預(yù)組48h(I-48h,n=12)。線栓法制備MCA局灶性缺血再灌注模型。干預(yù)組給予鹽酸法舒地爾注射

3、液5mg/kg,每12h一次,從缺血再灌注0h起給予腹腔注射,直至斷頭取腦;模型組在對應(yīng)時間點給予等量的生理鹽水。利用Longa的5級標準評分法評價神經(jīng)功能缺損變化;運用TTC染色法、TUNEL法和免疫組織化學(xué)檢測方法,分別檢測腦梗死體積變化、視前區(qū)細胞凋亡變化和視前區(qū)cathepsin B與p-JNK蛋白表達變化;通過使用雙變量相關(guān)分析統(tǒng)計方法和免疫熒光雙標激光共聚焦檢測法來分析cathepsin B和p-JNK蛋白表達的相關(guān)性和這兩

4、種蛋白的定位關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.模型成功率為86.84％;模型組48h相對梗死體積的變異系數(shù)為3.89%。
　　2.假手術(shù)組未見梗死灶,模型組及干預(yù)組缺血側(cè)皮層及皮層下出現(xiàn)白色的梗死灶;模型組48h相對梗死體積為28.52±1.11%,但干預(yù)組的相對腦梗死體積為13.43±0.86%,較模型組明顯減少(P<0.05),其神經(jīng)功能評分也得到明顯改善(P<0.05)。
　　3.在大鼠缺血側(cè)視前區(qū),假手術(shù)組基本

5、看不到凋亡細胞,模型組2h可觀察到細胞凋亡,6h增多,24h達高峰,48h有所下降(P<0.001);鹽酸法舒地爾明顯減少缺血再灌注后的凋亡細胞(P<0.001)。
　　4.在大鼠缺血側(cè)視前區(qū),假手術(shù)組未見明顯 cathepsin B免疫活性表達;再灌注開始就可見cathepsin B蛋白表達,2h明顯增加,6h達到高峰,24h降到最低,48h又有所增加(P<0.001);鹽酸法舒地爾干預(yù)組各個時間點的cathepsin B蛋白表

6、達較模型組無明顯變化(P>0.05)。
　　5.在大鼠缺血側(cè)視前區(qū),假手術(shù)組未見任何p-JNK陽性表達;模型組再灌注開始未見p-JNK的蛋白表達,再灌注2h可觀察到p-JNK陽性細胞表達,6h達到頂峰,再灌注24h降到最低,48h也有所增加( P<0.001);鹽酸法舒地爾可以明顯抑制 p-JNK免疫活性表達(P<0.05);干預(yù)組的p-JNK蛋白表達再灌注6h比2h還是有增高的趨勢,24h降低(P<0.05),再灌注48h與24

7、h相比變化不大(P>0.05)。
　　6.免疫熒光雙標顯示:在缺血側(cè)視前區(qū)缺血再灌注后cathepsin B和p-JNK表達共定位于再灌注2h、6h、24h和48h,而再灌注開始時只觀察到少量cathepsin B陽性細胞,并未見到p-JNK蛋白表達;再灌注6h兩種蛋白共染的細胞數(shù)量明顯增多并達到頂峰,隨后下降至再灌注24h,再灌注48h又有所增加(P<0.001)。
　　7.雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示:在缺血側(cè)視交叉前區(qū)缺血再