DHBV侵染規(guī)律和preS蛋白原核表達及在評價抗人類乙肝新藥的應用.pdf

1、本研究的創(chuàng)新點 1.從四川麻鴨分離到三株鴨乙型肝炎病毒(DHBV)，全基因組均含3006個核苷酸(GenBank登錄號EU429324，EU429325，EU429326)，具有X-like開放閱讀框特征。 2.對DHBVpreS基因進行原核表達并獲得純化preS重組蛋白及其多克隆抗體。 3.建立檢測DHBV的實時熒光定量PCR(FQ-PCR)和基于preS重組蛋白的免疫組化法，并結合組織學和血液生化指標對DHB

2、V在感染鴨體模型侵染規(guī)律進行系統(tǒng)觀察，建立起抗人類乙型肝炎新藥體內藥效評價的技術平臺。 4.對新研制藥物(代號PNA)在體外細胞抗人類乙型肝炎病毒(HBV)活性及體內的抗DHBV活性檢測結果為其進一步臨床前研究提供了重要的實驗數(shù)據。 鴨乙型肝炎病毒(DuckHepatitisBVirus，DHBV)與乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)同屬嗜肝DNA病毒科，這類病毒的特征是有強的嗜肝細胞特性，在病毒形態(tài)

3、、基因組結構、復制過程等生物學特性相似。DHBV感染鴨模型是研究HBV的生物學特性、致病機制和抗HBV藥物的實驗動物模型。本文通過調查四川地區(qū)麻鴨自然攜帶DHBV的情況，分離DHBV毒株，以此毒株為模板，擴增主要抗原基因preS。通過構建DHBV-preS原核表達質粒并誘導表達，從而對表達蛋白免疫原性、表達蛋白抗體介導的免疫組化檢測人工感染DHBV后在體內的蛋白定位分析與侵染規(guī)律，以期系統(tǒng)地了解的入侵方式和復制機理，為闡明DHBV的發(fā)病

4、機制提供關鍵的實驗數(shù)據。同時建立基于定量檢測DHBV的FQ-PCR方法，用于DHBV疾病模型研究，并結合體外模型HepG2.2.15細胞研究抗乙型肝炎新藥，結果如下： DHBV毒株的分離及分子特征解析結果表明：四川麻鴨自然攜帶DHBV4％，證實四川麻鴨是研究實驗性DHBV感染動物模型的良好鴨種；對分離到的其中3株DHBV陽性血清全基因克隆、測序并進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)全基因組均含3006個核苷酸(GenBank登錄號EH429

5、324，EU429325，EU429326)，具有X-like開放閱讀框特征；進一步研究ORF-S還表明該基因編碼33個氨基酸，有四個疏水區(qū)，無N-糖基化位點，也無豆蔻酰化位點，在1～30aa內有一個明顯的信號肽，在19～20aa處有斷點，跨膜螺旋預測為外膜蛋白，抗原位點主要分布于preS區(qū)氨基酸序列中。 根據DHBV-preS序列，設計一對特異性引物，以分離的DHBV毒株為模板擴增目標基因并將其克隆至pMD18-T載體，經PC

6、R、酶切和DNA測序鑒定后，將DHBV-preS基因正向插入原核表達載體pET-32a(+)的ApaI和NcoI位點間，成功構建了重組表達質粒pET32a(+)/DHBV-preS。重組表達質粒pET32a(+)/DHBV-preS轉化表達宿主菌BL21(DE3)，用IPTG誘導，能表達出了大小約為37kD的preS重組蛋白，與預期表達蛋白分子量大小相符；經對不同誘導時間及誘導劑IPTG濃度等條件進行優(yōu)化，確定重組質粒pET32a(+)

7、/DHBV-preS的最佳誘導條件為0.8mmol/LIPTG、37℃條件下誘導4h。表達產物用鎳柱親和層析純化后，將得到的preS重組蛋白做梯度稀釋，初步建立ELISA檢測DHBsAb的方法(間接法);同時將純化的重組蛋白與等量弗氏佐劑混合制備preS重組蛋白免疫原，四次免疫家兔，獲得的兔抗DHBV-preS高免血清經辛酸-硫酸銨粗提后，陰離子交換柱層析純化抗體IgG。 建立DHBV-preS基因表達蛋白抗體介導的免疫組化方法

8、;針對DHBV的保守序列設計并合成引物及熒光標記探針，建立實時熒光定量聚合酶鏈反應(fluorsescencequantitativepolymerasechainreaction，F(xiàn)Q-PCR)檢測方法。建立的標準曲線循環(huán)閾值(cyclethreshold，Ct值)與模板濃度具有良好的線性關系，相關系數(shù)為0.993，將其檢測極限的Ct值通過標準曲線換算成拷貝數(shù)約為5copies/L，未檢測到鴨病毒性肝炎、鴨瘟病毒、鴨源致病性大腸埃希氏

9、菌、鴨源致病性沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌，表明FQ-PCR檢測DHBV方法靈敏、特異性強。 采用鴨乙型肝炎病毒人工方法感染1日齡四川麻鴨，攻毒后于不同時間采血分離血清，采集肝臟、胰腺、腎臟、脾臟等組織或器官，經建立的DHBV-preS基因表達蛋白抗體免疫組化方法和FQ-PCR方法檢測DHBV在感染鴨體內侵染過程與定位分布，并結合組織學和血液生化指標對DHBV在感染鴨體模型侵染規(guī)律進行系統(tǒng)觀察。結果顯示：感染后2d可在血清和肝組織中

10、檢測出DHBVDNA，血清中DHBVDNA從感染后第10d～30dDHBVDNA的拷貝數(shù)保持在1.00E+09以上，肝組織中DHBVDNA的含量從感染后第5d～52d保持在5.00E+09以上；肝臟DHBVDNA第14d達到最高水平，而血清中DHBVDNA第22d達到最高水平。肝臟、胰腺、腎臟、脾臟的損傷程度與DHBVDNA水平成正相關；在感染后3～52d內的不同時間點從肝臟、胰腺、腎臟、脾臟及大腦六種組織器官中檢測出DHBsAg，DH

11、BsAg主要分布在細胞漿，少部分分布于細胞核，未能從食道、腺胃、肺、心臟、生殖器和肌肉中檢測到DHBsAg，表明DHBV嗜肝的同時具有泛嗜性，且在靶器官的侵染與分布具有一定選擇性；在感染后1～3d、52d以后各組織相繼不能檢出DHBsAg，感染后12～31d病毒在機體內各組織的分布最為廣泛，感染后4d肝臟開始出現(xiàn)DHBsAg陽性細胞，感染后6d腎臟、胰腺、脾臟相繼開始出現(xiàn)DHBsAg陽性細胞，而腦組織在感染后10d出現(xiàn)陽性細胞；肝臟的檢

12、出率最高，持續(xù)至52d，大腦的檢出率最低，分析表明該蛋白可能是膜蛋白,具有運輸核漿與引導病毒組分進入核內參與病毒復制的功能。DHBV感染后第4d，總蛋白和自蛋白含量開始降低，谷丙、谷草轉氨酶活性升高(P＜0.01)，乳酸脫氫酶活性升高(P＜0.01)，肌酐和尿素有變化但無規(guī)律，表現(xiàn)為升高趨勢，感染后44d開始，各項血液生化指標逐漸趨于正常值，表明DHBV引起肝臟損傷的同時累及腎臟。 在建立的抗人類乙型肝炎新藥體內藥效評價的技術平

13、臺和體外模型HepG2.2.15上評價抗乙型肝炎新研制藥物-核苷類似物(代號_PNA)的作用。在HepG2.2.15細胞系中，PNA有明確的抑制HBVDNA復制作用，抑制HasAg和HBeAg，在7.8～62.5μg/mL劑量范圍內有劑量-時間依賴關系，未見到明顯細胞學毒性;在鴨乙肝動物模型中,PNA對DHBVDNA抑制率達50％的最低用藥劑量為口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kgPNA對DHBV的抑制率與拉米夫定口服